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    重庆时时彩组六号码: 新抗生素卡莫霉素ACHEMOMYCINA及其制造方法.pdf

    关 键 词:
    抗生素 霉素 ACHEMOMYCINA 及其 制造 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN200610152133.6

    申请日:

    2006.09.14

    公开号:

    CN1923825A

    公开日:

    2007.03.07

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07D 303/32申请日:20060914授权公告日:20100519终止日期:20140914|||授权|||实质审查的生效|||公开
    IPC分类号: C07D303/32(2006.01); A61K31/336(2006.01); C12P17/02(2006.01); A61P35/00(2006.01); C12R1/365(2006.01) 主分类号: C07D303/32
    申请人: 中国医学科学院医药生物技术研究所;
    发明人: 孙承航; 王振; 周建琴; 汪月; 金文藻; 游雪甫; 高红; 赵立勋; 栾迎春
    地址: 100050北京市天坛西里1号
    优先权:
    专利代理机构: 北京华科联合专利事务所 代理人: 杨厚;王为
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200610152133.6

    授权公告号:

    |||1923825B||||||

    法律状态公告日:

    2015.11.04|||2010.05.19|||2007.05.02|||2007.03.07

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种新的卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制备方法、以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素A在制备抗肿瘤药物中的应用,所说卡莫霉素A是由诺卡氏菌地中??道直渲?747-64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的一种新角蒽环类抗生素(Angucycline),体外活性实验结果表明,卡莫霉素A对YES-2人食道癌细胞和HCT116结肠癌细胞有较好的抗肿瘤活性,作为一种新的抗肿瘤药物,具有良好的开发前景。

    权利要求书

    权利要求书
    1、  一种新抗生素卡莫霉素A(Chemomycin A),其结构如式(1)所示:


    2、  制备如权利要求1所述卡莫霉素A(Chemomycin A)的方法,其特征是所说方法包括以下步骤:
    1)卡莫霉素A的发酵培养;
    2)卡莫霉素A的提取分离;
    3)卡莫霉素A的结构鉴定。

    3、  如权利要求2所述的制备方法,其特征是发酵培养系将生长于斜面的诺卡氏菌地中??道直渲?747-64菌(保藏编号为:CGMCC No.1554)接种于种子培养基,在旋转摇床上培养,然后转入发酵培养基在往复振荡摇床上培养,收获发酵液;

    4、  如权利要求2所述的制备方法,其特征是提取分离系在发酵培养物中,加入弱酸如2N的盐酸,抽滤除去菌丝,得到上清液,再用非极性有机溶剂如乙酸乙酯或丙酮萃取,减压浓缩得到浸膏;浸膏先经硅胶柱层析,然后用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分进一步分离,洗脱溶剂采用甲醇;最后用制备型HPLC进行制备,冷冻干燥,得到目标化合物卡莫霉素A;

    5、  如权利要求2所述的制备方法,其特征是结构鉴定系根据UV、IR、HR-MS、分子式、1H-NMR、13C-NMR、DEPT数据测试和1H-1H相关谱(COSY)、1H-13C相关谱(HSQC)以及反向检测远程1H-13C异核多键相关谱(HMBC)的分析,确定目标化合物卡莫霉素A的结构。

    6、  权利要求1所述卡莫霉素A(Chemomycin A)的药物组合物,其特征是所说组合物系以卡莫霉素A(Chemomycin A)为有效成分,与一种或多种药学上可接受的载体所组成。

    7、  权利要求1所述卡莫霉素A(Chemomycin A)在制备抗肿瘤药物中的应用。

    8、  权利要求3所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

    说明书

    说明书新抗生素卡莫霉素A(Chemomycin A)及其制造方法
    技术领域:
    本发明涉及一种新的角蒽环类抗生素(Angucycline)卡莫霉素A及其制备方法、以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素A在制备抗肿瘤药物中的应用。
    背景技术:
    迄今发现来源于微生物的抗生素已近万种,其中许多作为医药,农药已得到广泛应用。Angucycline是一类来源于微生物的次级代谢产物,20世纪60年代发现第一个此类抗生素。这是一类全新的四环结构化合物,其结构与蒽环类抗生素相似,具有蒽醌四环结构,所不同的是,四环中的A环以角的形式骈在其它三环上,组成一种不对称的四环结构。大部分Angucycline抗生素都具有不同程度的细胞毒活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性较弱,个别此类抗生素还具有酶抑制活性,抗病毒活性,受体拮抗活性和免疫抑制活性[杨建新.国外药学抗生素分册9(2):98-109,1988]。由于这类抗生素具有广谱的生物学活性,它引起了世界上许多研究者的关注,并对这类抗生素进行了深入的研究。到目前为止,已经发现的Angucycline类抗生素有一百多个,但在Angucycline的B环6a和12a位含有环氧结构的只有少数几个抗生素[Rohr J,Nat ProdRep.9(2):103-137,1992;Sasaki T,J.Antibiotics 41(7):843-848,1988;Puder CJ,Antibiotics.53(4):329-336,2000;Tsukuda E,J.Antibiotics 49(4):333-339,1996]。
    随着新抗生素大规模筛选研究不断向纵深发展,微生物发酵液中含量高、易分离的主组分抗生素大多已被分离出来,发现新抗生素的难度越来越大了?;谛吕丛葱戮植驴股氐幕蚀蟮墓鄣?,如今人们已将注意力集中在放线菌中稀有放线菌的研究上,把它作为开辟新抗生素筛选的重要途径之一。
    本发明人在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中,分离得到具有抗肿瘤活性的Angucycline类抗生素-卡莫霉素A(Chemomycin A),经光谱及质谱数据分析,确定卡莫霉素A(Chemomycin A)是一个全新结构的抗生素。该结构式与迄今已知结构的所有Angucycline类抗生素不同,目前尚未见到与卡莫霉素A具有相同结构的相关报道。迄今为止,已经发现的Angucycline类抗生素中,也未见到有Angucycline类抗生素成为抗肿瘤药物上市的。因此,卡莫霉素A(ChemomycinA)作为一个新结构抗肿瘤抗生素具有良好的研发应用前景。
    本发明目的之一是,提供如式(1)所示结构的卡莫霉素A(Chemomycin A);
    本发明目的之二是,提供卡莫霉素A的制备方法;
    本发明目的之三是,提供以卡莫霉素A为活性成分的药物组合物;
    本发明目的之四是,提供卡莫霉素A及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
    发明内容:
    本发明提供了如式(1)所示结构的卡莫霉素A,

    通过一系列光谱学分析,确定了卡莫霉素A的结构。
    本发明所说的卡莫霉素A是一种白色粉末状物质,分子式为C19H20O9,其特征为一种具有蒽醌环的四环结构,其中B环的C-6a和C-12a上有环氧结构;易溶于甲醇,氯仿,二甲亚砜等溶剂;具有旋光活性,其在氯仿中的比旋光度为+22.4°;当氯仿∶甲醇=19∶1时,卡莫霉素A在硅胶板上的Rf=0.24(表1)。
    本发明所说卡莫霉素A是在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中,由诺卡氏菌地中??道直渲?747-64(Nocardia mediterranei var.kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的。所说产生菌已于2005年12月8日送交位于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行保藏,其保藏编号为:CGMCC No.1554。
    为了获得卡莫霉素A及其抗肿瘤活性,本发明采取了以下技术路线与步骤:
    1、卡莫霉素A的发酵及培养:首先是将生长于斜面的诺卡氏菌地中??道直渲?747-64菌接种于种子培养基,在旋转摇床上培养,然后转入发酵培养基在往复振荡摇床上培养,收获发酵液;
    2、卡莫霉素A的提取,分离:发酵培养物中,加入弱酸(如2N的盐酸等),抽滤除去菌丝,得到上清液,再用非极性有机溶剂(如乙酸乙酯)萃取,减压浓缩得到浸膏。浸膏先经过硅胶柱层析,然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离,洗脱溶剂为甲醇。然后用制备型HPLC进行制备,冷冻干燥,最后得到白色粉末目标化合物卡莫霉素A;
    3、卡莫霉素A的结构鉴定:根据UV、IR、HR-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT数据测试和1H-1H相关谱(1H-1H COSY)、1H-13C相关谱(HSQC)以及反向检测远程1H-13C异核多键相关谱(HMBC)的分析,确定了卡莫霉素A的结构;
    4、卡莫霉素A的生物活性:采用MTT法进行了体外抗肿瘤活性试验,所选用的肿瘤细胞株分别为YES-2人食道癌细胞和HCT116人结肠癌细胞。研究结果表明,卡莫霉素A具有明显的抗肿瘤活性。
    本发明还提供了卡莫霉素A的药物组合物。所说药物组合物,是以卡莫霉素A为活性成分,与药学上可接受的一种或多种载体所组成。
    以上所说药学上可接受的载体是指,药学领域常规的药物载体,如稀释剂、赋形剂如水等;填充剂如淀粉、蔗糖等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;湿润剂如甘油;崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂如季铵化合物;表面活性剂如十六烷醇;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙等。此外,还可在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
    本发明还提供了所说化合物及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
    发明效果:
    本发明提供的结构式(1)所示化合物是一个新的Angucycline类抗生素卡莫霉素A(Chemomycin A),经生物活性实验证明,该化合物具有较好的抗肿瘤作用,今后有望研制开发成为一个新的抗肿瘤抗生素。
    附图说明:
    图1-卡莫霉素A的紫外光谱;
    图2-卡莫霉素A的红外光谱;
    图3-卡莫霉素A的高分辨质谱;
    图4-卡莫霉素A在CD3OD中的1H-NMR谱;
    图5-卡莫霉素A在CD3OD中的13C-NMR谱;
    图6-卡莫霉素A在CD3OD中的DEPT谱;
    图7-卡莫霉素A在CD3OD中的1H-1H COSY相关谱;
    图8-卡莫霉素A在CD3OD中的H-13C相关谱;
    图9-卡莫霉素A在CD3OD中的HMBC谱;
    图10-卡莫霉素A在DMSO-d6中的1H-NMR谱;
    图11-卡莫霉素A在DMSO-d6中的13C-NMR谱;
    图12-卡莫霉素A在DMSO-d6中的DEPT谱;
    图13-卡莫霉素A在DMSO-d6中的1H-1H COSY相关谱
    图14-卡莫霉素A在DMSO-d6中的1H-13C相关谱;
    图15-卡莫霉素A在DMSO-d6中的HMBC谱。
    具体实施方案:
    以下实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
    实施例1:卡莫霉素A的发酵
    将生长于斜面的(2%可溶性淀粉、1%KNO3、0.05%NaCl、0.05%K2HPO4,、0.001%FeSO4·7H2O,、0.05%MgSO4·7H2O,、2%琼脂、pH7.0)Nocardiamediterranei var.kanglensis 1747-64菌接种于种子培养基(2%葡萄糖,1%黄豆粉,0.5%酵母粉,0.5%CaCO3,pH6.5)50ml/250ml的摇瓶,在28℃于旋转摇床上培养48小时,然后以5%的接种量,转入发酵培养基(3%葡萄糖、1%花生饼粉、1%酵母粉、0.5%蛋白胨、0.1%CaCO3,、pH6.5)100ml/500ml的三角瓶中,在28℃下于往复振荡摇床上培养72小时,收获发酵液共20L。
    实施例2:卡莫霉素A的提取
    发酵液用2N的HCl调pH至3~4,布氏漏斗里垫上滤纸抽滤,除去菌丝等,得到上清发酵液。用发酵液1/3体积的乙酸乙酯萃取三次,将三次萃取得到的乙酸乙酯合并后,加入无水硫酸钠干燥脱水,静置3~4小时,减压浓缩得到浸膏。
    实施例3:卡莫霉素A的分离
    浸膏先经过硅胶柱层析,以氯仿∶甲醇梯度洗脱进行初步分离,洗脱梯度分别为氯仿∶甲醇=100∶1(共为202ml),氯仿∶甲醇=20∶1(共为300ml),氯仿∶甲醇=9∶1(共为200ml),收集各个馏分,将含有目标化合物-卡莫霉素A的组分合并浓缩;然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离,洗脱溶剂为甲醇,流速为3ml/分钟,共用甲醇350ml,收集洗脱液中的各个组分,并将含有目标化合物(卡莫霉素A)的组分合并浓缩;然后再采用制备型HPLC进行制备,制备柱为Shimadzu公司的ODS柱(20mm×250mm,10μm),流速为4ml/分钟,进样量为200ul,洗脱条件为55%CH3OH-45%H2O,温度为室温25℃,然后挥干溶剂,冷冻干燥,得到卡莫霉素A的白色粉术,纯度为98.25%,共40mg。
    实施例4:卡莫霉素A的结构鉴定
    根据UV(图1)、IR(图2)、HR-MS(图3)、1H-NMR CD30D为溶剂(图4)、DMSO-d6为溶剂(图10)、13C-NMR CD3OD为溶剂(图5)、DMSO-d6为溶剂(图11)、DEPT CD3OD为溶剂(图6)、DMSO-d6为溶剂(图12)数据和1H-1H COSY相关谱CD3OD为溶剂(图7)、DMSO-d6为溶剂(图13)、1H-13C相关谱HSQC CD3OD为溶剂(图8)、DMSO-d6为溶剂(图14)以及反向检测远程1H-13C异核多键相关谱HMBC CD3OD为溶剂(图9)、DMSO-d6为溶剂(图15)的分析结果,确定了卡莫霉素A的结构。
                        表1.卡莫霉素A的理化特性  外观  白色粉末  分子量  分子式  HRSI-MS(m/z)Found:  Calcd:  [α]D20  λmaxMeOH nm(ε)  IRυmax(KBr)cm-1  Solubility  TLC,Rf值  392  C19H20O9  391.1033(M-H)+  391.1034  +22.4°(c 4.9×10-4,CHCl3)  217(19,282),260(8,991),335(4,564)  3410,1710,1653,1616,1456,1250,1053  MeOH,DMSO,CHCL3  0.24(CHCl3-MeOH,19∶1)
    本发明从1H-NMR(图4)和(图10),13C-NMR(图5)和(图11),DEPT谱(图6)和(图12)及HSQC谱(图8)和(图14)可以得到卡莫霉素A的以下结构信息:19个碳信号,其中2个羰基碳,6个芳香碳,7个有羟基取代的碳,1个次甲基碳,2个亚甲基碳,1个甲基碳;在1H-NMR DMSO-d6(图10)中有6个羟基质子信号,化学位移分别为11.4(酚羟基质子),7.2,6.6,6.2,5.4,5.1,但在1H-NMR CD3OD(图4)中,由于被氘代,看不见这六个质子信号;从IR谱(图2)中可以得到以下信息:羟基信号(3410cm-1),酮羰基信号1741cm-1),与羟基形成分子内氢键的羰基信号(1653cm-1),13C-NMR谱CD3OD溶剂(图5)中,这两个羰基的化学位移分别为204.02和201.02,当在13C-NMR谱DMSO-d6溶剂(图11)中,这两个羰基的化学位移分别为205.15和202.22;从1H-NMR谱(图4)和(图10)中可以清楚的看见H-9,H-10,H-11构成一个ABX系统,化学位移分别为6.8,7.5,7.2;在CD3OD溶剂中,C-8的化学位移为162.25,在DMSO-d6溶剂中,C-8的化学位移为160.16,这就提示,C-8上连接有酚羟基,这个酚羟基的化学位移在DMSO-d6中为11.4,并且与C-7的羰基形成氢键,这在HMBC谱CD3OD为溶剂(图9)、DMSO-d6为溶剂(图15)中可以得到佐证。通过化学位移的分析和不饱和度的计算,以及NMR数据与SF-2315B结构比较,确定了C,D环的结构。
    从1H-1H COSY谱CD3OD为溶剂(图7)、DMSO-d6为溶剂(图13)和HMBC谱(图9)和(图15)中可以得到卡莫霉素A还有如下两个结构片断的存在,:(A):6CH2-5CH2-4aCH和(B):12bC(OH)-1C(O)-2CH(OH)-(CH3)3C(OH)-4CH(OH)经过两种氘代溶剂(CD3OD和DMSO-d6)如下图所示HMBC的研究,确定卡莫霉素A的结构如式(1)所示。

    卡莫霉素A在CD3OD I和DMSO-d6 II中的NMR数据如表2所示。
                   表2.卡莫霉素A在CD3OD I和DMSO-d6 II中的NMR数据                     I              II  Position.  δCa  δHb(mult,J Hz)  δCa  δHb(mult,J Hz)  1  2   3-CH3  4  4a  5   6   6a  7  7a  8  9  10  11  11a  12  12a  12b  205.15  64.77  60.55  15.16  66.52  50.75  16.37   26.87   78.74  202.22  114.81  162.25  116.53  137.45  121.48  145.31  65.97  76.32  80.07   3.5(d,2)   1.4(s)  4.5(br s)  2.7(dd,12,3.5)  1.8(m)  2.1(m)  1.9(ddd,14.5,14.5,4.5)  2.1(m)      6.8(d,8.5)  7.5(dd,8,8)  7.2(d,7.5)   5.5(s)  204.02  62.45  58.65  15.29  64.52  49.16  14.89   25.33   77.22  201.20  113.42  160.16  115.15  136.37  120.09  144.76  64.37  75.60  78.41   3.5(d,2.5)   1.3(s)  4.5(br s)  2.7(dd,12,3.5)  1.7(m)  1.9(m)  1.8(ddd,14,14,4)  2.0(m)      6.8(d,8)  7.6(dd,8,8)  7.2(d,8.5)   5.4(br s)
    1H-NMR(500MHz,δin ppm),13C-NMR(125MHz,δin ppm)
    实施例5:卡莫霉素A的生物活性
    本发明采用MTT法进行体外抗肿瘤的活性试验,选用的细胞株为YES2人食管癌细胞和HCT116人结肠癌细胞。具体操作步骤是:将卡莫霉素A溶解在DMSO中,浓度范围为4ug/ml-128ug/ml。将处于对数生长期的YES2人食管癌细胞和HCT116结肠癌细胞经0.125%的胰酶消化,用RPMI 1640培养液稀释细胞至2500个/well,37℃,5%的CO2培养箱中恒温培养3天,每孔加入MTT 20ul,37℃继续培养4小时,用酶联免疫分析仪在570nm下读取吸光度值。实验结果表明,卡莫霉素A具有较好的抗肿瘤活性,对YES2人食管癌细胞的IC50为50ug/ml,对HCT116结肠癌细胞的IC50为60ug/ml。

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