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    重庆时时彩怎么玩会赢: 抗体精制用阳离子交换色谱法载体及抗体医药的制程中生产的抗体单体与其聚合物的分离法.pdf

    关 键 词:
    抗体 精制 阳离子 交换 色谱 载体 医药 制程中 生产 单体 与其 聚合物 分离法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201380052566.2

    申请日:

    2013.09.25

    公开号:

    CN104718450A

    公开日:

    2015.06.17

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20130925|||公开
    IPC分类号: G01N30/88; B01D15/08; B01J20/281; B01J39/04; B01J39/20; B01J39/26; C07K1/18; C07K16/00 主分类号: G01N30/88
    申请人: 捷恩智株式会社
    发明人: 石原尚; 须泽敏行; 铃木康公; 松本吉裕; 青山茂之
    地址: 日本东京千代田区大手町二丁目2番1号
    优先权: 2012-230396 2012.10.18 JP
    专利代理机构: 北京同立钧成知识产权代理有限公司11205 代理人: 杨贝贝; 臧建明
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201380052566.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.12.14|||2015.12.09|||2015.06.17

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种可适合用于精制抗体医药的阳离子交换色谱法用载体、特别是抗体医药的制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物的分离性能良好的阳离子交换色谱法用载体。本发明的阳离子交换色谱法载体是以单体整体的30~100mol%的范围含有下述式(1)或(2)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物结合于包含多孔性粒子的基础载体而成的抗体精制用阳离子交换色谱法载体,且其离子交换容量为60~300μmol/ml。[式中,R1、R2及R3分别独立为氢原子或甲基,A1及A2为-R4-SO3M,此处,R4为C2~C4的亚烷基,M为氢原子、钠或钾]。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种阳离子交换色谱法载体,其是以单体整体的30mol%~100mol%的范围含有式(1)或(2)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物结合于包含多孔性粒子的基础载体而成的抗体精制用阳离子交换色谱法载体,其中离子交换容量为60μmol/ml~300μmol/ml;
    [化1]

    [式中,R1、R2及R3分别独立为氢原子或甲基,A1及A2为-R4-SO3M,此处,R4为C2~C4的亚烷基,M为氢原子、钠或钾]。

    2.  根据权利要求1所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物还包含式(3)所示的至少1种中性单体单元、或式(4)所示的至少1种弱阳离子性单体单元:
    [化2]

    [式中,R1及R2分别独立为氢原子或甲基,R5及R6分别独立为氢原子、C1~C4的烷基或C1~C4的烷氧基甲基],
    [化3]

    [式中,R1及R2分别独立为氢原子或甲基,A3为氢原子、钠或钾]。

    3.  根据权利要求2所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物包含式(1)所示的至少1种强阳离子性单体单元、与式(3)所示的至少1种中性单体单元。

    4.  根据权利要求3所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与N,N-二甲基丙烯酰胺的聚合物。

    5.  根据权利要求3或4所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物所包含的强阳离子性单体单元的比率为40mol%以上且小于100mol%,并且离子交换容量为60μmol/ml~150μmol/ml。

    6.  根据权利要求2所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物包含式(1)所示的至少1种强阳离子性单体单元、与式(4)所示的至少1种弱阳离子性单体单元。

    7.  根据权利要求6所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为2-丙烯酰胺-2-甲基 丙磺酸与丙烯酸的聚合物。

    8.  根据权利要求6或7所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物所包含的强阳离子性单体单元的比率为50mol%以上且小于100mol%,并且离子交换容量为90μmol/ml~250μmol/ml。

    9.  根据权利要求1所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为包含式(1)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物。

    10.  根据权利要求9所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的聚合物。

    11.  根据权利要求9或10所述的阳离子交换色谱法载体,其中离子交换容量为70μmol/ml~250μmol/ml。

    12.  根据权利要求1至11中任一项所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述多孔性粒子为交联纤维素粒子。

    13.  根据权利要求1至12中任一项所述的阳离子交换色谱法载体,其中所述多孔性粒子是具有如下特征的多孔性粒子,即在重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷中使用纯水作为流动相时的凝胶分配系数Kav为0.3~0.5。

    14.  根据权利要求1至13中任一项所述的阳离子交换色谱法载体,其用以将抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物进行分离。

    15.  一种抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物的分离方法,使用根据权利要求1至14中任一项所述的阳离子交换色谱法载体,将抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物进行分离。

    说明书

    说明书抗体精制用阳离子交换色谱法载体及抗体医药的制程中生产的抗体单体与其聚合物的分离法
    技术领域
    本发明涉及一种抗体医药的精制步骤中所使用的阳离子交换色谱法载体及抗体医药的制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物的分离方法。
    背景技术
    使用色谱法进行生物医药品的精制已众所周知,且利用各种分子间相互作用而进行目标物与杂质的分离。作为例,有利用离子交换色谱法的静电相互作用的分离方法、利用疏水色谱法的疏水性相互作用的分离方法及利用蛋白A色谱法等的对抗体的亲和相互作用的分离方法等。
    在抗体医药的制造中,重要的是提供纯度高的制品,其精制工艺是将蛋白A色谱法、阳离子交换色谱法及阴离子交换色谱法等组合而实施。其中,作为杂质之一的抗体聚合物生产于培养或精制阶段,可认为是抗原辨识能力降低或产生副作用的原因,去除该抗体聚合物于抗体医药制造中成为重要的管理项目。
    在生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)108,1494-1508,2011(非专利文献1)中报告有抗体聚合物的生成机制及聚合物去除的重要性等,但存在如下问题:抗体聚合物在利用蛋白A色谱法的亲和精制步骤中无法去除。因此,在利用蛋白A色谱法的精制步骤以后的步骤中将抗体与其聚合物进行分离而获得纯度高的抗体对抗体医药厂商而言成为重要的课题。
    为了此种目的,例如在非专利文献1中提出有利用具有混合模式(mix-mode)型配体的色谱法载体进行抗体与其聚合物的分离。另外,在J.Chromatography A,1217,216-224,2010(非专利文献2)及J.Chromatography A,1216,902-909,2009(非专利文献3)中提出有利用疏水(苯基)色谱法载体进行抗体与其聚合物的分离。但是,这些使用载体的分离方法存在较多实用性课题,例如,成为目标物的抗体的吸附容量低,或者是在高盐浓度下使用。
    阳离子交换色谱法是用以去除抗体聚合物、来自宿主的蛋白质、及蛋白A泄露,该阳离子交换色谱法廉价,且在制造大量生物制剂时使用实绩高,从而在蛋白A色谱法以后的精制步骤中成为非常重要的步骤。因此,期望利用阳离子交换色谱法处理尽量地减少在抗体医药的制造过程中产生的抗体聚合物或来自宿主的蛋白质等杂质。
    关于阳离子交换色谱法对抗体精制的适应性,例如在国际公开第2010/127069号手册(专利文献1)中揭示有胰岛素样生长因子-1受体(Insulin-like Growth Factor-1Receptor,IGFlR)的精制,且揭示有对去除抗体聚合物等杂质有效的阳离子交换体的使用。
    但是,在用于抗体医药制造的情况下,对于阳离子交换色谱法载体而言,不仅要求与杂质的分离性能,就生产性的观点而言,还要求抗体的吸附量高,进而可在不压缩的情况下以 高流速进行处理。
    近年来,开发、贩卖有Capto(注册商标)S(通用电气医疗(GE healthcare)公司制造)、TOYOPEARL(注册商标)GigaCap S(东曹公司制造)、Fractogel(注册商标)SE Hicap及Eshmuno(注册商标)S(以上由默克公司制造)、UNOsphere(注册商标)S(伯乐(BIO-RAD)公司制造)、POROS(注册商标)XS(应用生物系统(APPLIED BIOSYSTEMS)公司)等作为具有高吸附容量的蛋白质精制用阳离子交换色谱法载体。
    例如,在日本专利特开平1-310744号公报(专利文献2)中揭示有具有接枝聚合物作为配体的离子交换色谱法载体的制造方法。此处,记载有使用Fractogel(注册商标)TSK HW 65(S)或LiChrospher(注册商标)二醇作为基础载体的阳离子交换色谱法及阴离子交换色谱法、进而具有共聚物作为配体的色谱法载体的制造方法。但是,在本报告例中,没有对抗体与其聚合物的分离进行研究。
    作为所述以外的具有接枝聚合物作为配体的阳离子交换色谱法载体的例,例如在日本专利特表2011-529508号公报(专利文献3)中揭示有通过接枝聚合将共聚物作为配体导入Fractogel(注册商标)TSK HW 65(M)的方法。在该公报中记载有如下情况:通过使含有磺酸的单体与不含有磺酸的单体进行共聚合,而与仅使含有磺酸的单体进行接枝聚合的情况相比,接触时间2分钟内所测得的多株抗体的动态结合容量变高。但是,在该公报中,没有明确地揭示共聚物的组成与动态结合容量的关系。另外,在该公报中,没有认识到共聚物的强阳离子基与中性基的组成对抗体与其聚合物的分离所造成的影响的重要性,也没有对其进行研究。
    在日本专利特表2010-528271号公报(专利文献4)中,揭示有使用具有疏水性相互作用的单体,将具有离子交换基与疏水基两者的接枝聚合物作为配体导入Fractogel(注册商标)TSK HW 65(M)而成的阳离子交换色谱法载体。在该公报中记载有如下情况:通过使用该色谱法载体,即便在NaCl为150mM的浓度条件下单株抗体也显示76.1mg/ml的动态结合容量(表3)。但是,在此处也没有对抗体与其聚合物的分离进行研究。
    另一方面,在国际公开第2007/123242号手册(专利文献5)中记载有如下情况:以甲基丙烯酸系聚合物为原料的使聚丙烯酸作为配体结合于基础载体而成的载体与使羧甲基直接结合于基础载体而成的载体相比,抗体单体与其聚合物的分离优异。但是,在制造所述载体的情况下,必须事先合成聚丙烯酸,而有可能无法应对如下课题,即提供抗体医药厂商所期望的廉价的色谱法载体。另外,没有对抗体结合容量等其它重要的色谱法载体特性进行研究,在实用性方面留有课题。
    如上所述,可有效率地将抗体单体与其聚合物进行分离且吸附性高的具有接枝聚合物作为配体的阳离子交换色谱法载体尚未被人所知。
    现有技术文献
    专利文献
    专利文献1:国际公开第2010/127069号手册
    专利文献2:日本专利特开平1-310744号公报
    专利文献3:日本专利特表2011-529508号公报
    专利文献4:日本专利特表2010-528271号公报
    专利文献5:国际公开第2007/123242号手册
    非专利文献
    非专利文献1:Biotechnology and Bioengineering 108,1494-1508,2011
    非专利文献2:J.Chromatography A,1217,216-224,2010
    非专利文献3:J.Chromatography A,1216,902-909,2009
    发明内容
    发明欲解决的课题
    在此种状况下,期望提供一种可适合用于精制抗体医药的离子交换色谱法载体,尤其是抗体医药的制造过程中所生产的抗体单体与作为其聚合物的抗体聚合物的分离性能良好、且抗体吸附性高、能以高纯度获得抗体单体的阳离子交换色谱法载体。
    解决课题的手段
    本发明人等人为解决所述课题而进行努力研究,结果发现,通过于多孔性粒子上结合使含有至少一个砜基的单体以特定组成聚合而成的结构物作为配体,而可提供可有效率地将抗体单体与其聚合物进行分离,而且抗体吸附性高的阳离子交换色谱法载体,从而完成本发明。
    即,本发明涉及以下所示的抗体精制用阳离子交换色谱法载体及抗体单体与其聚合物的分离方法等。
    [1]一种阳离子交换色谱法载体,其是以单体整体的30mol%~100mol%的范围含有式(1)或(2)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物结合于包含多孔性粒子的基础载体而成的抗体精制用阳离子交换色谱法载体,且其离子交换容量为60μmol/ml~300μmol/ml:
    [化1]

    [式中,R1、R2及R3分别独立为氢原子或甲基,A1及A2为-R4-SO3M,此处,R4为C2~C4的亚烷基,M为氢原子、Na或K]。
    [2]根据所述[1]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物还包含式(3)所示的至少1种中性单体单元、或式(4)所示的至少1种弱阳离子性单体单元:
    [化2]

    [式中,R1及R2分别独立为氢原子或甲基,R5及R6分别独立为氢原子、C1~C4的烷基或C1~C4的烷氧基甲基]
    [化3]

    [式中,R1及R2分别独立为氢原子或甲基,A3为氢原子、Na或K]。
    [3]根据所述[2]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物包含式(1)所示的至少1种强阳离子性单体单元、与式(3)所示的至少1种中性单体单元。
    [4]根据所述[3]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与N,N-二甲基丙烯酰胺的聚合物。
    [5]根据所述[3]或[4]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物所包含的强阳离子性单体单元的比率为40mol%以上且小于100mol%,且离子交换容量为60μmol/ml~150μmol/ml。
    [6]根据所述[2]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物包含式(1)所示的至少1种强阳离子性单体单元、与式(4)所示的至少1种弱阳离子性单体单元。
    [7]根据所述[6]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与丙烯酸的聚合物。
    [8]根据所述[6]或[7]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物所含有的强阳离子性单体单元的比率为50mol%以上且小于100mol%,且离子交换容量为90μmol/ml~250μmol/ml。
    [9]根据所述[1]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为包含式(1)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物。
    [10]根据所述[9]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述聚合物为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的聚合物。
    [11]根据所述[9]或[10]所记载的阳离子交换色谱法载体,其中离子交换容量为70μmol/ml~250μmol/ml。
    [12]根据所述[1]至[11]中任一项所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述多孔性粒子为交联纤维素粒子。
    [13]根据所述[1]至[12]中任一项所记载的阳离子交换色谱法载体,其中所述多孔性粒子是具有如下特征的多孔性粒子,即在重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷中使用纯水作为流动相时的凝胶分配系数Kav为0.3~0.5。
    [14]根据所述[1]至[13]中任一项所记载的阳离子交换色谱法载体,其用以将抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物进行分离。
    [15]一种分离方法,其是使用根据所述[1]至[14]中任一项所记载的阳离子交换色谱法载体,将抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物进行分离。
    发明效果
    本发明的阳离子交换色谱法载体可适合用于精制抗体医药。根据本发明的优选实施方式,通过使用本发明的阳离子交换色谱法载体,可有效率地将抗体医药的制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物进行分离,因此能以高纯度获得抗体单体。
    附图说明
    图1是表示利用实施例1的凝胶获得的单株抗体的分离度(ΔC)的测定结果的色谱图。
    图2是表示利用实施例2的凝胶获得的单株抗体的分离度(ΔC)的测定结果的色谱图。
    具体实施方式
    以下,对本发明的抗体精制用阳离子交换色谱法载体及使用其对抗体单体与其聚合物进行分离的方法等详细地进行说明。
    (1)抗体精制用阳离子交换色谱法载体
    本发明的抗体精制用阳离子交换色谱法载体的特征在于具有如下结构,且其离子交换容量为60μmol/ml~300μmol/ml:于包含多孔性粒子的基础载体上结合有以单体整体的30mol%~100mol%的范围含有式(1)或(2)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物作为配体;
    [化4]

    [式中,R1、R2及R3分别独立为氢原子或甲基,A1及A2为-R4-SO3M,此处,R4为C2~C4的亚烷基,M为氢原子、Na或K]。
    (1.1)作为基础载体的多孔性粒子
    在本发明的阳离子交换色谱法载体中,用作基础载体的多孔性粒子只要具有用以导入强阳离子性单体单元、以及视需要的中性单体单元及弱阳离子性单体单元的官能基(例如,羟基或胺甲?;?,则没有特别限制。此种多孔性粒子可优选列举:具有如上所述的官能基的例如琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖(pullulan)、甲壳素、壳聚糖、三乙酸纤维素、二乙酸纤维素等多糖类及其衍生物;聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烷基乙烯醚、聚乙烯醇等有机聚合物等。这些多孔性粒子就可确?;登慷鹊姆矫娑?,优选形成交联结构。在这些多孔性粒子中,本发明中优选使用利用交联反应而强化了纤维素粒子的骨架的交联纤维素粒子。
    本发明所使用的交联纤维素粒子只要为通常用作色谱法的基础载体的交联纤维素粒子,则没有特别限制。成为原料的纤维素可为结晶纤维素,也可为非晶纤维素,但就强度高的方面而言,优选结晶纤维素。
    可适合在本发明中使用的交联纤维素粒子例如可列举日本专利特开2009-242770号公报所揭示的多孔性纤维素凝胶。利用所述日本专利特开2009-242770号公报所揭示的交联方法(即,在纤维素单体的摩尔数的6倍量~20倍量的选自由盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐及硼酸盐所组成的族群中的至少1种无机盐的存在下,历时3小时以上向未交联纤维素粒子的悬浊液中连续地滴加或者分批添加纤维素单体的摩尔数的4倍量~12倍量的交联剂、与交联剂的摩尔 数的0.1倍量~1.5倍量的碱而进行交联的方法)而获得的交联纤维素粒子可提供机械强度高、能在高流速下使用、生产性高的阳离子交换色谱法载体。此处,所谓“纤维素单体”,意指作为纤维素的结构单元的葡萄糖单元,且纤维素单体的摩尔数(即,聚合度)是将自葡萄糖1单元减去水分而获得的量、即分子量162设为1摩尔,并根据纤维素的干燥重量进行计算。
    交联纤维素粒子的形状并无特别限制,就机械强度高,凝胶沉淀性优异,可制作均匀的填充床的方面而言,优选球状的交联纤维素粒子。在该情况下,交联纤维素粒子的真球度(sphericity)优选0.8~1.0。此处“真球度”意指纤维素粒子的短径/长径。
    球状纤维素粒子例如可通过使结晶纤维素或包含结晶区域与非晶区域的纤维素溶解再生而容易地获得。球状纤维素的制造方法例如可列举:日本专利特公昭55-39565号公报、日本专利特公昭55-40618号公报等所记载的利用乙酸酯的方法、日本专利特公昭63-62252号公报等所记载的自使用硫氰酸钙盐的溶液进行造粒的方法、日本专利特开昭59-38203号公报等所记载的自多聚甲醛·二甲基亚砜溶液进行制造的方法、以及日本专利第3663666号公报所记载的自使纤维素溶解于含氯化锂的酰胺中而成的纤维素溶液进行成形的方法等。另外,球状的交联纤维素粒子可通过使球状纤维素粒子交联而获得。
    本发明所使用的多孔性粒子的粒径优选10μm~500μm,更优选30μm~200μm,特别优选50μm~150μm。另外,平均粒径优选30μm~1000μm,更优选40μm~200μm,进而优选50μm~100μm。
    此外,在本说明书中,多孔性粒子的粒径及平均粒径是使用以如下方法为测定原理的激光衍射/散射式的粒径分布测定装置而算出,所述方法是对粒子群照射激光,根据自粒子群发出的衍射·散射光的强度分布图案由计算求出粒度分布。测定装置可使用堀场制作所股份有限公司的激光衍射/散射式的粒径分布测定装置LA-950等。
    或者,可使用游标卡尺等对光学显微镜所拍摄的图像的粒径进行测量,并根据拍摄倍率求出实际的粒径。然后,可根据自光学显微镜照片求出的各粒径的值,由下述式算出平均粒径。
    体积平均粒径(MV)=∑(nd4)/Σ(nd3)
    [式中,nd表示自光学显微镜照片求出的各粒径的值,n表示所测定的粒子的个数]
    在本发明中用作基础载体的多孔性粒子的多孔性可将细孔尺寸的特性作为特征。表示细孔尺寸特性的指标之一有凝胶分配系数Kav。细孔尺寸是与粒子的物理强度或成为精制对象的目标物质在粒子内的扩散性相关,因此对载体的流速特性或动态吸附容量造成影响。因此,必须视目的而进行最适设计。就动态吸附容量的观点而言,特别是本发明所使用的多孔性粒子的细孔尺寸优选如下特性,即在重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷中使用纯水作为流动相时的凝胶分配系数Kav为0.15~0.6的范围,更优选凝胶分配系数Kav为0.2~0.55,进而优选凝胶分配系数Kav为0.3~0.5。
    凝胶分配系数Kav可根据具有特定分子量的标准物质(例如,聚环氧乙烷)的溶出体积及色谱柱体积的关系,利用下式求出。
    Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)
    [式中,Ve表示样品的保持容量(mL),Vt表示空色谱柱体积(mL),V0表示蓝葡聚糖保持容量(mL)]
    凝胶分配系数Kav的测定方法例如记载在L.Fischer著生物化学实验法2“凝胶色谱法(Gel Chromatography)”第1版(东京化学同人)等中。本发明所使用的交联多孔质纤维素粒子的凝胶分配系数Kav例如可通过控制粒子形成时的纤维素的溶解浓度而进行调整。
    在本发明中用作基础载体的多孔性粒子中,只要为不损害本发明的目的及作用效果的范围,则也可导入苯基或丁基等疏水基等任意取代基。向多孔性粒子导入疏水基的情况下,可通过在碱性溶液中使苯基缩水甘油醚或丁基缩水甘油醚等进行反应而导入。
    (1.2)作为配体的聚合物
    在本发明的抗体精制用阳离子交换色谱法载体中,在所述多孔性粒子上结合有以单体整体的30mol%~100mol%的范围含有式(1)或(2)所示的至少1种强阳离子性单体单元的聚合物作为配体:
    [化5]

    [式中,R1、R2及R3分别独立为氢原子或甲基,A1及A2为-R4-SO3M,此处,R4为C2~C4的亚烷基,M为氢原子、Na或K]
    R4的C2~C4的亚烷基没有特别限制,可优选列举:亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚异丁基、亚仲丁基等。
    在本发明中,所述聚合物可为仅包含式(1)和/或(2)所示的强阳离子性单体单元的聚合物,也可为除包含式(1)和/或(2)所示的强阳离子性单体单元外,还包含中性单体或弱阳离子性单体等其它任意单体单元的聚合物。所述聚合物所含有的强阳离子性单体单元可仅为式(1)或(2)所示的单体单元中的任一单体单元,也可为式(1)所示的单体单元与式(2)所示的单体单元的组合。式(1)或(2)所示的单体单元可分别使用1种,也可分别使用2种以上。另外,所述聚合物所任意包含的其它单体单元可使用1种,也可使用2种以上。
    在所述聚合物仅包含式(1)和/或(2)所示的强阳离子性单体单元,而不包含其它任意单体单元的情况下,所获得的阳离子交换色谱法载体的离子交换容量为60μmol/ml以上,更优选70μmol/ml以上,进而优选90μmol/ml以上。另外,离子交换容量为300μmol/ml以下,更优选250μmol/ml以下,进而优选150μmol/ml以下。在离子交换容量为该范围时,抗体单体与其聚合物的分离性能变良好。
    此外,在本说明书中,离子交换容量例如通??衫萌绻使?007/027139号手册所记载的酸碱滴定或如色谱分析法杂志A卷(Joumal of ChromatographyA),1146,202-215所记载的反滴定(back titration)而求出。
    式(1)所示的单体的具体例可列举:2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、2-丙烯酰胺乙磺酸、2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、2-甲基丙烯酰胺乙磺酸等。其中,优选2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸。
    式(2)所示的单体的具体例可列举:甲基丙烯酸3-磺丙酯、甲基丙烯酸2-磺乙酯等。其中,优选甲基丙烯酸3-磺丙酯。
    在所述聚合物除包含式(1)或(2)所示的强阳离子性单体单元外,还包含其它任意单 体单元的情况下,其它单体单元只要不损害本发明的目的,则没有特别限制。其它单体单元例如可优选列举式(3)所示的至少1种中性单体单元、或式(4)所示的弱阳离子性单体单元:
    [化6]

    [式中,R1及R2分别独立为氢原子或甲基,R5及R6分别独立为氢原子、C1~C4的烷基或C1~C4的烷氧基甲基]
    [化7]

    [式中,R1及R2分别独立为氢原子或甲基,A3为氢原子、Na或K]。
    此处,C1~C4的烷基没有特别限制,可优选列举:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。C1~C4的烷氧基甲基只要为包含碳数1~4的烷基的烷氧基甲基,则没有特别限制,可优选列举:甲氧基甲基、乙氧基甲基、正丙氧基甲基、异丙氧基甲基、正丁氧基甲基、异丁氧基甲基、仲丁氧基甲基、叔丁氧基甲基等。
    在本发明的一实施方式中,所述聚合物也可包含中性单体单元及弱阳离子性单体单元两者。
    式(3)所示的中性单体的具体例可列举:N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、N,N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-(甲氧基甲基)甲基丙烯酰胺、N-(异丁氧基甲基)甲基丙烯酰胺等。
    式(4)所示的弱阳离子性单体的具体例可列举:丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸钠、丙烯酸钾、甲基丙烯酸钠、甲基丙烯酸钾等。
    在本发明的阳离子交换色谱法载体中用作配体的所述聚合物可通过包含中性单体单元和/或弱阳离子性单体单元而赋予进而优选的特性。
    例如使包含式(1)所示的强阳离子性单体单元、与式(3)所示的中性单体单元的共聚物作为配体结合于基础载体而成的阳离子交换色谱法载体可期待吸附量、特别是动态吸附容量的增加效果。另外,该阳离子交换色谱法载体因抗体单体与其聚合物的分离性能优异,可有效率地将抗体单体进行分离精制,故而优选。其中,如果使用2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与N,N-二甲基丙烯酰胺的共聚物作为配体,则分离性能特别优异。
    另外,使包含式(1)所示的强阳离子性单体单元、与式(4)所示的弱阳离子性单体单元的共聚物作为配体结合于基础载体而成的阳离子交换色谱法载体不仅可期待吸附量、特别是动态吸附容量的增加效果,而且抗体单体与其聚合物的分离性能优异。弱阳离子性单体也可作为在蛋白质的精制领域中通常所应用的弱阳离子交换体的配体发挥功能,通过弱阳离子 基的效果,也可对本发明的阳离子交换色谱法载体期待来自宿主的杂质的去除效果等。
    在所述聚合物为具有式(1)和/或(2)所示的强阳离子性单体单元、与式(3)所示的中性单体单元的共聚物的情况下,强阳离子性单体单元相对于构成共聚物的单体整体的比率为30mol%以上,优选40mol%以上,更优选50mol%以上。另外,强阳离子性单体单元的比率小于100mol%。
    如果进一步考虑动态吸附容量,则离子交换容量为60μmol/ml以上,优选70μmol/ml以上,更优选90μmol/ml以上,特别优选100μmol/ml以上。另外,离子交换容量为300μmol/ml以下,优选250μmol/ml以下,更优选210μmol/ml以下,特别优选150μmol/ml以下。
    在最适的实施方式中,强阳离子性单体单元的比率为40mol%以上且小于100mol%,且离子交换容量为60μmol/ml~150μmol/ml。
    在所述聚合物为具有式(1)和/或(2)所示的强阳离子性单体单元、与式(4)所示的弱阳离子性单体单元的共聚物的情况下,强阳离子性单体单元相对于构成共聚物的单体整体的比率为30mol%以上,优选40mol%以上,更优选50mol%以上。另外,强阳离子性单体单元的比率小于100mol%。
    如果进一步考虑动态吸附容量,则离子交换容量为60μmol/ml以上,优选70μmol/ml以上,更优选90μmol/ml以上。另外,离子交换容量为300μmol/ml以下,优选250μmol/ml以下。
    在最适的实施方式中,强阳离子性单体单元的比率为50mol%以上且小于100mol%,且离子交换容量为90μmol/ml~250μmol/ml。
    此外,在本说明书中,强阳离子性单体单元的比率(S密度)可通过如下方式获得,即使用所测得的S含量、N含量或Na含量而算出单体单元所包含的S相对于N或Na的摩尔比。S含量、N含量或Na含量例如可使用发射光谱分析法、元素分析法或原子吸光分析法等而进行测定。
    (1.3)阳离子交换色谱法载体的制造方法
    接着,对本发明的抗体精制用阳离子交换色谱法载体的制造方法进行说明。
    本发明的阳离子交换色谱法载体可通过利用接枝聚合反应,将聚合物导入包含多孔性粒子的基础载体而制造。本发明中,接枝聚合反应是以自由基为基点而进行,该自由基是羟基在酸性条件下通过Ce(IV)的作用而产生。通过使成为该基点的自由基与系统中所存在的单体进行反应而于基础载体上形成接枝聚合物。
    具体而言,首先向反应容器添加纯水与强阳离子性单体,进行溶解后,利用氢氧化钠溶液等碱进行中和。向该溶液视需要添加追加的单体,并添加基础载体而制成浆料状。在该状态下,一边向反应容器吹送氮气,一边搅拌0.5小时~4.0小时。搅拌后,向反应容器慢慢地滴加使硫酸铵铈等Ce(IV)盐溶解于稀硝酸而成的溶液。滴加后,将反应溶液升温至10℃~70C的范围、优选30℃~50℃的范围,并搅拌6小时~40小时小时。反应结束后,利用纯水对所获得的湿凝胶进行清洗,接着利用稀硫酸进行清洗后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性,而可获得目标的阳离子交换色谱法载体。
    反应优选在pH值为0~4的范围的溶液中进行。
    Ce(IV)盐以反应溶液中的摩尔浓度计优选为0.0001mol/ml~l mol/ml的范围,如果为0.01mol/ml~0.1mol/ml的范围,则更优选。
    反应所使用的强阳离子性单体、与中性单体及弱阳离子性单体等其它单体的添加量的摩尔比优选99∶1~40∶60的范围,更优选70∶30~45∶55的范围。
    此外,关于使用Ce(IV)的接枝聚合反应,可参照聚合物科学杂志(Journal of Polymer Science),1958,No.122,242-243。
    (2)分离方法
    本发明的抗体精制用阳离子交换色谱法载体因抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物的分离性能优异,所以可适合在生物医药品等的精制步骤中使用。具体而言,向色谱柱填充本发明的阳离子交换色谱法载体,使包含目标物与杂质的液体流向其中,而用以仅吸附目标物或杂质,或者用以将目标物与杂质一起吸附,通过阶段性或连续地增加溶出时的盐浓度而利用对色谱法载体的亲和性差异进行分离。
    本发明所使用的抗体可列举单株抗体或多株抗体??固宓闹掷嗬缈闪芯伲盒∈罂固?、美洲驼抗体、嵌合抗体(chimeric anfibody)、人源化抗体(humanized antibody)、人类抗体或者改变了这些抗体的Fc区域等的抗体等,分子型例如可列举:IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、Fab、Fc、Fc-融合蛋白、VH、VL、VHH、Fab′2、scFv、scFab、scDb或scDbFc等。
    另外,本发明所使用的抗体还包括使这些单株抗体或多株抗体的一部分积极改性而成的单株抗体或多株抗体。单株抗体或多株抗体的改性方法例如可列举Joumal of PHARMACEUTICAL SCIENCES,2011,100,2104-2119所记载的方法。
    本发明中所谓抗体单体,是包含1分子的所述抗体的分子。所谓抗体聚合物,是2分子以上的抗体的单体通过共价键结或非共价键结聚合而成的分子,例如可列举:二聚物、三聚物、多聚物、凝聚体或凝聚块等。
    通过使用本发明的阳离子交换色谱法载体进行阳离子交换色谱法,可将设为目标的抗体单体与其聚合物进行分离。
    进而,使用本发明的阳离子交换色谱法载体的阳离子交换色谱法还可用于分离抗体医药制造过程中所生产的抗体单体与杂质。杂质可列举在培养过程或其它色谱法处理步骤等中所产生的杂质,例如:来自培养细胞的蛋白质、核酸、病毒、蛋白A泄露、抗体的分解物、及经过改性、糖链成分的去除、氧化或脱酰胺等的目标抗体的修饰体等。
    供于该阳离子交换色谱法的含抗体的水溶液例如可列举:血浆、血清、奶或尿等自生物获得的组合物、使用基因重组技术或细胞融合技术而获得的产生抗体的细胞或大肠杆菌等菌类的培养液、或自转基因非人类动物、植物或昆虫等获得的组合物等。
    产生抗体的细胞例如可列举:编码所需抗体的基因被组入宿主细胞而成的转形细胞等。宿主细胞例如可列举:动物细胞、植物细胞或酵母细胞等细胞株。具体而言,例如可列举:中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、作为小鼠骨髓瘤细胞的NSO细胞、SP2/O细胞、作为大鼠骨髓瘤细胞的YB2/O细胞、IR983F细胞、作为来自叙利亚仓鼠肾脏的细胞的BHK细胞、作为人类骨髓瘤细胞的那马瓦细胞(Namalwa cell)、胚胎干细胞、或受精卵细胞等。
    培养产生抗体的细胞的培养基只要为适合培养各种细胞的培养基,则都可使用,例如培养动物细胞的培养基可使用通常的动物细胞的培养所使用的培养基。例如可使用含血清的培养基、不含有血清白蛋白或血清区分物等来自动物的成分的培养基、无血清培养基、或无蛋白培养基等任一种培养基,优选使用无血清培养基或无蛋白培养基。另外,可视需要而添加产生抗体的细胞生长所必需的生理活性物质或营养因子等。这些添加物可在培养前事先含于 培养基中,或者在培养中作为添加培养基或添加溶液向培养液中适当地追加供给。关于追加供给的方法,可为1种溶液或2种以上的混合溶液等任意形态,另外,关于添加方法,可连续地进行添加,也可间断地进行添加。
    产生抗体的转基因非人类动物、植物或昆虫可列举:编码蛋白质的基因被组入细胞内的非人类动物、植物或昆虫。非人类动物例如可列举:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、绵羊、猪、山羊、?;蚝镒拥?。植物例如可列举:烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、紫苜蓿、大米、小麦、大麦或玉米等。
    另外,在本发明中,供于该阳离子交换色谱法的含抗体的水溶液除包含如上所述的含有抗体的血浆或尿等自生物获得的含抗体的水溶液外,还包含在精制步骤中所获得的含抗体的水溶液。具体而言,例如可列举:细胞去除液、沉淀物去除液、醇区分液、盐析区分液、色谱法溶出液等。进而,含抗体的水溶液在存在粒子等不溶物的情况下,也可事先将这些不溶物去除,在将不溶物去除后供于本发明的精制方法。粒子等不溶物的去除方法例如可列举:离心分离法、扫流过滤法(cross flow filtration)(切向流过滤法(tangential flow filtration))、利用深度过滤器的过滤法、利用薄膜过滤器的过滤法、透析法、或将这些方法组合而成的方法。
    另外,可视需要使用例如使用超过滤膜的超过滤法等,将含抗体的水溶液的pH值、导电率、缓冲液、盐浓度、添加物、抗体浓度或阳离子交换色谱法载体的每单位体积的抗体负载量等调整为适当的条件后,供于该阳离子交换色谱法。
    作为将含抗体的水溶液的pH值、导电率、缓冲液、盐浓度、添加物、抗体浓度或阳离子交换色谱法载体的每单位体积的抗体负载量等进行调整的方法,例如可列举使用超过滤膜的超过滤法等。
    该阳离子交换色谱法视其目的而以吸附模式或非吸附模式进行。所谓该阳离子交换色谱法中的吸附模式,意指使供于该阳离子交换色谱法的含抗体的水溶液与该载体接触,使目标抗体吸附于该载体后,视需要进行清洗,其后使之在变更了pH值、导电率、缓冲液成分、盐浓度或添加物等的缓冲液中溶出,而将吸附组分(fraction)进行回收。所谓该阳离子交换色谱法中的非吸附模式,意指使供于该阳离子交换色谱法的含抗体的水溶液与该载体接触,回收未吸附于该载体的组分。此时,通过回收适当的组分,而可将目标抗体单体与欲分离的化合物进行分离。关于清洗或溶出所使用的缓冲液的pH值、导电率、缓冲液成分、盐浓度或添加物等,各自选定适当的条件。
    在选定色谱法的条件的情况下,利用目标抗体单体与欲分离的化合物对色谱法载体的亲和性的差异。例如考虑载体结构(配体种类、配体密度、配体配行性、粒径、细孔径、基础基质组成等)、或目标物与欲分离的化合物的物理化学性质(等电点、电荷、疏水性度、分子尺寸或立体结构等)的差异而进行条件设定。
    吸附模式的溶出方法可列举:通入如目标抗体单体与载体的亲和性会降低的特定的盐浓度或pH值的缓冲液而使目标抗体单体溶出的一阶段溶出法、阶段性地改变盐浓度或pH值而使目标抗体单体溶出的逐步(step-wise)法、或者连续地改变盐浓度或pH值而使目标抗体单体溶出的梯度法。
    含抗体的水溶液及清洗或溶出所使用的缓冲液的成分只要为具有缓冲能力的成分,则没有特别限定,例如可列举:1mmol/L~300mmol/L的磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、 马来酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷(碱)(Tris(base))、HEPES、MES、PIPES、MOPS、TES或三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)等。另外,所述的盐也可与例如氯化钠、氯化钾、氯化钙、柠檬酸钠、硫酸钠或硫酸铵之类的其它盐组合使用。进而,缓冲液成分也可与例如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或组氨酸等氨基酸、葡萄糖、蔗糖、乳糖、唾液酸等糖或其衍生物等组合使用。
    含抗体的水溶液及清洗或溶出所使用的缓冲液的pH值优选2~9的范围,更优选3~8的范围。
    含抗体的水溶液及清洗或溶出所使用的缓冲液的线速度优选50cm/h~1000cm/h的范围。
    阳离子交换色谱法载体的每单位体积的抗体负载量优选10g/L~200g/L,更优选60g/L~150g/L的范围。
    在抗体医药制造中,使用本发明的阳离子交换色谱法载体的阳离子交换色谱法也可进而组合其它精制方法。与该阳离子交换色谱法组合的精制方法只要为适合制造医药品的方法,则都可使用。例如可列举:色谱法、活性碳处理、醇区分、沉淀物去除、盐析、缓冲液交换、浓缩、稀释、过滤、病毒惰性化、病毒去除等。与该阳离子交换色谱法组合的精制方法也可组合多个种类、数量。另外,这些与该阳离子交换色谱法组合的精制方法可在该阳离子交换色谱法前实施,也可在该阳离子交换色谱法后实施。
    与该阳离子交换色谱法组合的色谱法所使用的载体或膜可列举:肝素载体或蛋白A载体等亲和载体、阳离子交换载体、阳离子交换膜、阴离子交换载体、阴离子交换膜、凝胶过滤载体、疏水性相互作用载体、逆相载体、羟磷灰石载体、氟磷灰石载体、硫酸化纤维素载体、硫酸化琼脂糖载体、混合模式(多模式)载体等。
    在本发明的阳离子交换色谱法载体的特性中,表示抗体单体与其聚合物的分离特性的指标之一例如可列举使用单株抗体的分离度ΔC或使用多株抗体的分离度ΔCp。
    分离度ΔC或ΔCp可将含有包含聚合物的单株抗体或多株抗体的溶液添加于填充有阳离子交换色谱法载体的色谱柱,对溶出液的单体或聚合物的波峰进行监控,作为所获得的单体或聚合物的峰顶所对应的导电率值的差而求出。ΔC或ΔCp的值越大,则抗体单体与其聚合物的分离能力越高。
    另外,表示吸附性的指标之一例如可列举10%动态结合容量(DBC)。10%动态结合容量是将浓度已知的含抗体的溶液添加于填充有阳离子交换色谱法载体的色谱柱,监控溶出液的吸光度,自发现所添加的样品的吸光度漏出10%的时点的蛋白质添加量而算出。10%动态结合容量的值越大,则抗体的吸附性越高。
    [实施例]
    以下,列举实施例而对本发明进一步详细地进行说明,但本发明并不受这些实施例任何限定。此外,实施例及比较例中的离子交换容量、多株抗体的10%动态结合容量、S含量、N含量、Na含量、分离度ΔC及ΔCp是通过测定法1~7所记载的方法而进行测定。
    <参考例1>
    [6%球状纤维素粒子(含水)的制造]
    (1)向100g的硫氰酸钙60重量%水溶液添加6.4g的晶质纤维素(旭化成化学股份有限公司制造,商品名:Ceolus PHl01),加热至110℃~120℃而进行溶解。
    (2)向该溶液添加作为表面活性剂的山梨醇酐单油酸酯6g,并滴加于事先加热至130℃~ 140℃的邻二氯苯480ml中,以200rpm~300rpm进行搅拌分散。
    (3)接着,将所述分散液冷却至40℃以下,注入甲醇190ml中而获得粒子的悬浊液。
    (4)将该悬浊液进行过滤分级,利用甲醇190ml清洗粒子,进行过滤分级。将该清洗操作进行数次。
    (5)进而利用大量的水进行清洗后,获得球状纤维素粒子。
    (6)接着,将该球状纤维素粒子置于JIS标准筛网规格53μm~125μm的筛网上,使粒径成为所需的粒径(实际粒子尺寸间隔50μm~150μm,平均粒径约100μm),而获得目标的6%球状纤维素粒子(含水:纤维素溶解浓度6%)。此外,此处的平均粒径是使用游标卡尺等对光学显微镜所拍摄的图像的粒径进行测量,根据拍摄倍率而求出实际的粒径,并根据各粒径的值,由下述式算出而求得。
    体积平均粒径(MV)=∑(nd4)/Σ(nd3)
    [式中,nd表示自光学显微镜照片求出的各粒径的值,n表示所测定的粒子的个数]
    [交联6%纤维素粒子的制备]
    (1)向所述获得的6%球状纤维素粒子(含水)100g添加121g的纯水,一边进行搅拌一边进行加温。达到30℃时添加45重量%的NaOH水溶液3.3g与NaBH40.5g并进行搅拌。初期碱浓度为0.69%(w/w)。
    (2)30分钟后,将60g的Na2SO4添加于反应液,并使之溶解。在混合物的温度达到50℃的时点继续搅拌2小时。
    (3)在50℃下继续搅拌混合物,同时每隔15分钟历时约6小时而添加将45重量%的NaOH水溶液48g与表氯醇50g分别等分为25份的量。
    (4)添加结束后,使该混合物在温度50℃下反应16小时。
    (5)将该混合物冷却至温度40℃以下后,添加乙酸2.6g进行中和。
    (6)将反应混合物进行过滤,回收凝胶,利用纯水进行过滤清洗,而获得目标的交联6%纤维素粒子。此时,使用堀场制作所股份有限公司的激光衍射/散射式的粒径分布测定装置LA-950进行分析而获得的平均粒径为85μm。另外,在重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷中使用纯水作为流动相时的凝胶分配系数Kav为0.38。
    <参考例2>
    [10%球状纤维素粒子(含水)的制造]
    (1)向313g的硫氰酸钙60重量%水溶液添加34.8g的晶质纤维素(旭化成化学股份有限公司制造,商品名:Ceolus PH301),加热至110℃~120℃并进行溶解。
    (2)向该溶液添加作为表面活性剂的山梨醇酐单油酸酯1.83g,并滴加于事先加热至130℃~140℃的邻二氯苯480ml中,以200rpm~300rpm进行搅拌分散。
    (3)接着,将所述分散液冷却至40℃以下,注入甲醇533ml中,而获得粒子的悬浊液。
    (4)将该悬浊液进行过滤分级,利用甲醇620m1清洗粒子,进行过滤分级。将该清洗操作进行数次。
    (5)进而利用大量的水进行清洗后,获得球状纤维素粒子。
    (6)接着,将该球状纤维素粒子置于JIS标准筛网规格53μm~125μm的筛网上,使粒径成为所需的粒径(实际粒子尺寸间隔50μm~150μm,平均粒径约100μm),而获得目标的10%球状纤维素粒子(含水:纤维素溶解浓度10%)。此处的平均粒径是利用与参考例1的“6% 球状纤维素粒子(含水)的制造”中所述的方法相同的方法求出。
    [交联10%纤维素粒子的制备]
    (1)向所述获得的10%球状纤维素粒子(含水)100g添加199g的纯水,一边进行搅拌一边进行加温。达到30℃时添加45重量%的NaOH水溶液4.46g与NaBH40.71g并进行搅拌。初期碱浓度为0.69%(w/w)。
    (2)30分钟后,将81g的Na2SO4添加于反应液,并使之溶解。在混合物的温度到达50℃的时点继续搅拌2小时。
    (3)在50℃下继续搅拌混合物,同时每隔15分钟历时约6小时而添加将45重量%的NaOH水溶液62g与表氯醇64g分别等分为25份的量。
    (4)添加结束后,使该混合物于温度50℃下反应16小时。
    (5)将该混合物冷却至温度40℃以下后,添加乙酸3.3g进行中和。
    (6)将反应混合物进行过滤,回收凝胶,利用纯水进行过滤清洗,而获得目标的交联10%纤维素粒子。此时,使用堀场制作所股份有限公司的激光衍射/散射式的粒径分布测定装置LA-950进行分析而获得的平均粒径为93μm。另外,在重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷中使用纯水作为流动相时的凝胶分配系数Kav为0.27。
    <实施例1>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水64.4g与2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸8.7g并进行溶解。接着,添加48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液3.4g,进行中和。接着,添加参考例1的交联6%纤维素粒子80.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌1小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈5.19g溶解于0.17mol/ml硝酸18.1ml而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用80ml的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸120ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液160ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为110μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为61mg/ml,S含量为3.1%(w/w),ΔC为6.6mS/cm,ΔCp为26mS/cm。
    <实施例2>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水64.4g与2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸8.7g并进行溶解。接着,添加48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液3.4g,进行中和。接着,添加N,N-二甲基丙烯酰胺2.3g。接着,添加参考例1的交联6%纤维素粒子80.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌1小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈5.19g溶解于0.17mol/ml硝酸而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用80ml的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸120ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液160ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为126μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为114mg/ml,S含量为2.8%(w/w),N含量为2.1%,ΔC为6.1mS/cm,ΔCp 为22mS/cm。
    <实施例3>
    将N,N-二甲基丙烯酰胺的添加量变更为4.5g,除此以外,以与实施例2相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为130μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为119mg/ml,S含量为2.6%(w/w),N含量为2.9%(w/w),ΔCp为18mS/cm。
    <实施例4>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水50.6g与2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸3.0g并进行溶解。接着,添加48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液1.2g,进行中和。接着,添加N,N-二甲基丙烯酰胺0.62g。接着,添加参考例l的交联6%纤维素粒子60.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌l小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈3.7g溶解于0.17mol/ml硝酸13.9ml而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用60m1的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸90ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液120ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为66μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为73mg/ml,S含量为1.7%(w/w),N含量为1.2%,ΔC为6.8mS/cm,ΔCp为22mS/cm。
    <实施例5>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为12.2g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为4.85g,将N,N-二甲基丙烯酰胺的添加量变更为6.4g,除此以外,以与实施例4相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为210μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为101mg/ml,S含量为3.8%(w/w),N含量为4.2%(w/w),ΔCp为17mS/cm。
    <实施例6>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为13.1g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为5.2g,将N,N-二甲基丙烯酰胺的添加量变更为5.30g,除此以外,以与实施例2相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为172μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为93mg/ml,S含量为3.2%(w/w),N含量为3.5%(w/w),ΔC为5.8mS/cm,ΔCp为18mS/cm。
    <比较例A>
    将N,N-二甲基丙烯酰胺的添加量变更为10.1g,除此以外,以与实施例2相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为130μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为125mg/ml,S含量为2.3%(w/w),N含量为4.1%(w/w),ΔCp为13mS/cm。
    <比较例B>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为12.6g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为5.0g,将N,N-二甲基丙烯酰胺的添加量变更为23.2g,除此以外,以与实施例2相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为102μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为5mg/ml,S含量为2.6%(w/w),N含量为6.2%(w/w)。
    <比较例C>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为18.5g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为7.35g,将N,N-二甲基丙烯酰胺的添加量变更为8.49g,除此以外,以与实施例4相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为318μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为44mg/ml,S含量为4.6%(w/w),N含量为4.9%(w/w),ΔCp为19mS/cm。
    <比较例D>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水33.3g与2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸1.25g并进行溶解。接着,添加48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液0.49g,进行中和。接着,添加丙烯酸0.14g。接着,添加参考例1的交联6%纤维素粒子40.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌l小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈2.45g溶解于0.17mol/ml硝酸9.2ml而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用40ml的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸60ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液80ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为48μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为45mg/ml,S含量为0.95%(w/w),Na含量为1.1%,ΔC为6.6mS/cm,ΔCp为23mS/cm。
    <实施例7>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为2.02g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为0.82g,将丙烯酸的添加量变更为0.39g,除此以外,以与比较例D相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为97μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为77mg/ml,S含量为1.5%(w/w),Na含量为2.0%(w/w),ΔC为6.5mS/cm,ΔCp为22mS/cm。
    <实施例8>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为4.07g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为1.62g,将丙烯酸的添加量变更为1.56g,除此以外,以与比较例D相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为246μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为70mg/ml,S含量为2.3%(w/w),Na含量为4.8%(w/w),ΔC为4.7mS/cm,ΔCp为19mS/cm。
    <实施例9>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水32.7g与2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸2.16g并进行溶解。接着,添加48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液0.86g,进行中和。接着,添加参考例l的交联6%纤维素粒子40.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌1小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈2.60g溶解于0.17mol/ml硝酸9.1ml而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用40ml的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸60ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液80ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为60μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为53mg/ml,S含量为1.6%(w/w),ΔC为6.3mS/cm,ΔCp为26mS/cm。
    <实施例10>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为4.07g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为1.62g,除此以外,以与实施例1相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为240μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为38mg/ml,S含量为5.1%(w/w),ΔCp为25mS/cm。
    <比较例E>
    将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的添加量变更为19.4g,将48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液的添加量变更为7.70g,除此以外,以与实施例9相同的方式获得湿凝胶。此时的离子交换容量为404μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为26mg/ml,S含量为7.4%(w/w),ΔC为7.9mS/cm,ΔCp为25mS/cm。
    <实施例l1>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水66.4g与甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐7.02g并进行溶解。接着,添加参考例1的交联6%纤维素粒子80.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌1小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈5.20g溶解于0.17mol/ml硝酸18.1ml而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用80ml的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸120ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液160ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为124μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为45mg/ml,ΔCp为28mS/cm。
    <实施例12>
    向500ml可分离式烧瓶添加纯水91.5g与2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸4.20g并进行溶解。接着,添加48.7%(w/w)氢氧化钠水溶液1.67g,进行中和。接着,添加参考例2的交联10%纤维素粒子50.0g而制成浆料。于该状态下一边向可分离式烧瓶内吹送氮气一边搅拌1小时。1小时后,自滴加漏斗慢慢地向可分离式烧瓶内添加使硝酸铵铈5.07g溶解于0.17mol/ml硝酸17.7ml而成的溶液。滴加结束后升温至40℃,搅拌22小时。22小时后停止搅拌,将浆料进行抽气过滤。利用50ml的纯水对所获得的湿凝胶清洗5次。接着,利用1mol/L硫酸75ml清洗10次后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。提取此时的湿凝胶的一部分而另外用于测定离子交换容量。其后,利用0.5mol/L氢氧化钠水溶液100ml进行清洗。最后,利用纯水进行清洗直至清洗液成为中性。所获得的湿凝胶是在去除了多余水分的状态下进行保存。此时的离子交换容量为111μmol/ml,多株抗体的10%动态结合容量为38mg/ml,S含量为1.5%(w/w),ΔCp为24mS/cm。
    [测定法1]
    使用多株抗体的10%动态结合容量(DBC)的测定
    (1)使用机器及试剂
    LC系统:AKTA explorer 10S(注册商标)
    缓冲液:乙酸缓冲液pH值5.0、0.05mol/L的NaCl
    多株抗体:来自人血清的γ-球蛋白(和光纯药)
    色谱柱:直径5mm,长度5cm
    (2)测定方法
    首先,使抗体溶解于缓冲液中而制作1mg/ml的抗体溶液。然后,向色谱柱以没有间隙的方式填充加成有离子交换基的凝胶。接着,将色谱柱连接于系统,使用缓冲液,以流速1mL/min进行平衡化直至色谱柱流出液的UV(紫外线吸光度、280nm)与导电率、pH值变固定。其后,将基准线的UV设为零。接着,使抗体溶液以流速0.5mL/min流向色谱柱。监控色谱柱流出液的UV,在色谱柱流出液的UV达到事先所测得的抗体溶液的UV的10%的时点停止流入抗体溶液。利用下式求出10%动态结合容量。此外,该分析是在25℃的房间内进行。
    {抗体溶液浓度(mg/ml)×自开始流入抗体溶液至结束流入抗体溶液的时间(min)×流速(ml/min)-无效体积}/色谱柱体积=10%动态结合容量(mg/ml)
    此处,无效体积(dead volume)是将系统配管体积与色谱柱空隙体积相加所得的体积(ml)。
    [测定法2]
    使用包含聚合物的单株抗体的分离度(ΔC)的测定
    (1)使用机器及试剂
    LC系统:AKTA explorer 10S(注册商标)
    A缓冲液:柠檬酸缓冲液pH值5.0
    B缓冲液:柠檬酸缓冲液pH值5.0、0.5mol/L的NaCl
    色谱柱:直径5mm,长度5cm
    (2)分离度(ΔC)的测定
    将填充有凝胶的色谱柱连接于系统,利用包含80容量%的A缓冲液与20容量%的B缓冲液的混合溶液的平衡化缓冲液进行平衡化。将1ml的单株抗体溶液应用于色谱柱。应用结束后,将5色谱柱容量的平衡化缓冲液通入色谱柱。耗费30色谱柱容量而使B缓冲液的比率自20容量%增加至100容量%,使所吸附的单株抗体溶出。关于流速,全部以0.66ml/min实施。
    (3)分离度(ΔC)的计算方法
    通过(2)的分析而获得单体及聚合物的波峰。将对应于单体的峰顶的导电率设为C1(mS/cm),将对应于聚合物的峰顶的导电率设为C2(mS/cm),由下式求出ΔC。
    ΔC(mS/cm)=C2(mS/cm)-Cl(mS/cm)
    (4)精制结果
    将通过本分离度(ΔC)的测定而获得的使用实施例1及实施例2的凝胶的单株抗体的分析结果(色谱图)分别示于图1及图2。
    [测定法3]
    使用改性多株抗体的分离度(ΔCp)的测定
    (1)使用机器及试剂
    LC系统:AKTA explorer 10S(注册商标)
    A缓冲液:乙酸缓冲液pH值5.0、0.05mol/L的NaCl
    B缓冲液:乙酸缓冲液pH值5.0、1.0mol/L的NaCl
    改性多株抗体:记载在(2)中
    色谱柱:直径5mm,长度5cm
    (2)改性多株抗体的制作方法
    改性多株抗体是依据Joumal of PHARMACEUTICAL SCIENCES,2011,100,2104-2119所记载的方法而制作。即,使来自人血清的2mg的γ-球蛋白(和光纯药)溶解于pH值3.5的20mmol/L磷酸/柠檬酸缓冲液1ml中。使用块状加热器(block heater)于55℃下加热15分钟。其后,利用冰浴进行冷却。使用PD-10(通用电气医疗),对乙酸缓冲液pH值5.0、0.05M的NaCl进行缓冲液交换。改性多株抗体的生成确认是使用凝胶过滤色谱法进行。使用之前是以冷蔵进行保存。
    (3)分离度(ΔCp)的测定
    将填充有凝胶的色谱柱连接于系统,利用A缓冲液进行平衡化。使用试样环路(sampleloop),将1ml的改性多株抗体溶液应用于色谱柱。将未吸附部分清洗后,历时120分钟,使B缓冲液的比率自0容量%增加至100容量%。关于流速,全部以0.5ml/min实施。
    (4)分离度(ΔCp)的计算方法
    通过(3)的分析而获得两个波峰。将前波峰的峰顶的溶出容量所对应的导电率设为C1(mS/cm),将后波峰的峰顶所对应的导电率设为C2(mS/cm),由下式求出ΔCp。
    ΔCp(mS/cm)=C2(mS/cm)-C1(mS/cm)
    [测定法4]
    离子交换容量的测定
    在实施例1~12及比较例A~D中,将进行硫酸清洗后经纯水清洗的凝胶1ml添加于烧杯,添加0.01mol/L氢氧化钠溶液40ml与酚酞溶液1滴。向该溶液添加0.1mol/L盐酸直至溶液的颜色变透明。如果将变透明为止所添加的盐酸量设为A ml,则各凝胶每1ml的离子交换容量(IEC)可利用下式求出:
    (0.01×40/1000-0.1×A/1000)×1000000(μmol/ml)。
    在比较例E中,将0.01mol/L氢氧化钠溶液的量自40m1变更为60ml,除此以外,利用与所述方法相同的方式制备溶液。比较例E中所获得的凝胶1ml的离子交换容量可利用下式求出:
    (0.01×60/1000-0.1×A/1000)×1000000(μmol/ml)。
    [测定法5]
    S含量的测定
    将实施例1~10、12、比较例A~E的凝胶加以干燥,通过感应耦合等离子体(INDUCTIVELY COUPLED PLASMA,ICP)发射光谱分析而求出每干燥重量的S含量(重量%)。
    [测定法6]
    N含量的测定
    将实施例2~6及比较例A~C的凝胶加以干燥,通过碳氢氮(Carbon Hydrogen Nitrogen,CHN)元素分析而求出每干燥重量的N含量(重量%)。
    [测定法7]
    Na含量的测定
    将实施例7、8及比较例D的凝胶加以干燥,通过原子吸光分析而求出每干燥重量的Na含量(重量%)。
    [S密度的计算法]
    (i)实施例1~6及比较例A~C
    使用在测定法4、测定法5中所测得的S含量、N含量的值,由下式求出共聚物中的强阳离子性单体单元的比率(s密度)。
    ((S含量/32)/(N含量/14)}×100(%)
    (ii)实施例7、8及比较例D
    使用在测定法4、测定法7中所测得的S含量、Na含量的值,由下式求出共聚物中的强阳离子性单体单元的比率(S密度)。
    (S含量/32)/(Na含量/23)×100(%)
    此外,在所述实施例中,使用式(1)所示的单体单元作为强阳离子性单体,所以为了方便起见,可通过求出上式所示的S密度而估算共聚物中所包含的强阳离子性单体单元的比率。
    将各实施例及比较例的结果示于表1~3。
    在表1中,表示中性单体的导入对本发明的阳离子交换色谱法载体的动态吸附容量与分离特性所造成的影响。
    [表1]

    基础载体:交联纤维素粒子
    配体:强阳离子性单体单元与中性单体单元的共聚物
    在表2中,表示弱阳离子单体的导入对本发明的阳离子交换色谱法载体的动态吸附容量与分离特性所造成的影响。
    [表2]

    基础载体:交联纤维素粒子
    配体:强阳离子性单体单元与弱阳离子性单体单元的共聚物
    在表3中,表示强阳离子单体导入量、强阳离子单体的结构差异及交联纤维素粒子的Kav的差异对本发明的阳离子交换色谱法载体的动态吸附容量与分离特性所造成的影响。
    [表3]

    基础载体:交联纤维素粒子
    配体:仅包含强阳离子性单体单元的共聚物
    工业上的可利用性
    本发明的抗体精制用阳离子交换色谱法载体可有效率地将抗体医药的制造过程中所生产的抗体单体与其聚合物进行分离,因此可适合用于生物医药品的精制等。

    关于本文
    本文标题:抗体精制用阳离子交换色谱法载体及抗体医药的制程中生产的抗体单体与其聚合物的分离法.pdf
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