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    重庆时时彩什么封盘了: 用于通过靶向肿瘤干细胞的SSDNA复制中间物而抑制肿瘤生长的方法和药剂.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN200880020171.3

    申请日:

    2008.06.12

    公开号:

    CN101720436A

    公开日:

    2010.06.02

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 专利权的视为放弃IPC(主分类):G01N 33/50放弃生效日:20170111|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/50申请日:20080612|||公开
    IPC分类号: G01N33/50; A61P35/00; A61K31/00; A61K39/00; A61K48/00 主分类号: G01N33/50
    申请人: 麻省理工学院
    发明人: 艾连纳·V.·寇斯特·杰华; 威廉·G.·希利
    地址: 美国马萨诸塞州
    优先权: 2007.06.13 US 60/934,420
    专利代理机构: 北京银龙知识产权代理有限公司 11243 代理人: 钟晶
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200880020171.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.01.11|||2010.07.21|||2010.06.02

    法律状态类型:

    专利权的视为放弃|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本申请案是基于以下观察结果:肿瘤干细胞(TSC)复制涉及复制中间物构型,其中当钟形细胞核开始分离成2个细胞核时,TSC基因组的很大一部分是以单链DNA(ssDNA)形式存在。在这种复制中间物构型期间,大量ssDNA因此存在于细胞核中,而申请者提出其为抗肿瘤疗法的靶标。本发明主张一种筛选靶向ssDNA的抗肿瘤发生药剂的方法和所述药剂在治疗中的用途。

    权利要求书

    1: 一种鉴别抑制肿瘤生长的药剂的方法,其包含: A)使受试者或宿主动物的肿瘤与候选药剂接触,其中所述肿瘤包含含钟形细胞核的肿瘤干细胞,且其中一些或所有所述钟形细胞核呈与ssDNA相关的复制中间物构型; B)在适合所述候选药剂与所述肿瘤相互作用的条件下保持所述肿瘤与所述药剂接触; C)切下所述肿瘤的样品,且确定在步骤B)中的所述接触后所述肿瘤样品中含有ssDNA的钟形细胞核的存在、不存在或数目、或单独ssDNA的存在、不存在或量;和 D)比较在与所述候选药剂接触后所述肿瘤样品中含有ssDNA的钟形细胞核的存在、不存在或数目、或单独ssDNA的存在、不存在或量与对照样品中含有ssDNA的钟形细胞核的存在、不存在或数目、或单独ssDNA的存在、不存在或量, 由此,在与所述候选药剂接触后所述样品中含有ssDNA的钟形细胞核的数目减少或不存在、或单独ssDNA的量减少或不存在表示所述药剂抑制肿瘤生长。
    2: 根据权利要求1所述的方法,其中所述肿瘤样品是从宿主生物体中的异种移植物所产生的实体瘤获得。
    3: 根据权利要求1所述的方法,其中ssDNA是通过用吖啶橙将所述样品染色且使所述ssDNA显像来检测。
    4: 根据权利要求1所述的方法,其中所述候选药剂靶向单链DNA。
    5: 根据权利要求4所述的方法,其中所述候选药剂破坏DNA的退火,降解单链DNA,或破坏从单链DNA模板复制DNA。
    6: 根据权利要求1所述的方法,其中含有ssDNA的钟形细胞核的存在、不存在或数目是通过检测呈所述复制中间物构型或极接近所述复制中间物构型的一种或一种以上肿瘤干细胞特异性分子来确定。
    7: 根据权利要求1所述的方法,其中可选地,步骤C)包含检测在与所述候选药剂接触后所述肿瘤干细胞或所述肿瘤自身的形态变化,且其中步骤D)包含比较在与所述候选药剂接触后所述肿瘤干细胞或肿瘤的形态与对照样品中的肿瘤干细胞或肿瘤的形态;且由此,肿瘤干细胞或肿瘤形态的变化表示所述药剂抑制肿瘤生长。
    8: 一种治疗受试者肿瘤的方法,其包含使所述受试者的肿瘤干细胞与结合、修饰或降解ssDNA的药剂接触,其中所述肿瘤干细胞的特征为含有ssDNA且呈复制中间物构型的钟形细胞核,且所述药剂结合、修饰或降解ssDNA,由此抑制或防止所述钟形细胞核分裂,从而抑制或防止肿瘤干细胞增殖或所述肿瘤生长。
    9: 根据权利要求8所述的方法,其中所述药剂是化学药剂。
    10: 根据权利要求9所述的方法,其中所述化学药剂是烷化剂。
    11: 根据权利要求10所述的方法,其中所述烷化剂是选自由以下组成的组:双-(氯乙基)-胺、双-(2-氯乙基)-硫醚、2,2′-双-(2″-氯乙基硫基)-二乙醚、1,2-双-(2′-氯乙基硫基)-乙烷、三-(2-氯乙基)-胺、双-(2-氯乙基)-乙胺、双-(2-氯乙基)-甲胺、氮丙啶(ethyleneimine)、溴氮丙啶、环磷酰胺、丙卡巴肼(procarbazine)、氮烯唑胺(dacarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、顺二胺二氯铂(II)、环磷脒、异环磷酰胺(fosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、双氯乙基亚硝脲(BCNU)、罗氮芥(CCNU)、甲基-罗氮芥(CCNU)、N-亚硝 基-N-甲脲、N-乙基-N-亚硝基脲和其它亚硝基脲。
    12: 根据权利要求8所述的方法,其中所述药剂是酶。
    13: 根据权利要求12所述的方法,其中所述酶是选自由以下组成的组:单链DNA核酸内切酶、脱氧核糖核酸酶VI、S1核酸酶、核酸内切酶V、APOBEC3G和催化性RNA分子。
    14: 根据权利要求8所述的方法,其中所述药剂包含ssDNA结合部分。
    15: 根据权利要求14所述的方法,其中所述ssDNA结合部分具有序列特异性。
    16: 根据权利要求14所述的方法,其中所述ssDNA结合部分是对ssDNA具有特异性的单克隆抗体。
    17: 根据权利要求14所述的方法,其中所述ssDNA结合部分是来自ssDNA结合蛋白的ssDNA结合域。
    18: 根据权利要求17所述的方法,其中所述ssDNA结合域是来自选自由以下组成的组的ssDNA结合蛋白:聚(ADP-核糖)聚合酶、hnRNP蛋白、单链DNA结合蛋白和RecA。
    19: 根据权利要求14所述的方法,其中所述ssDNA结合部分是反义寡核苷酸或单链寡核苷酸。
    20: 根据权利要求19所述的方法,其中所述寡核苷酸是ssDNA、RNA、PNA或能够与ssDNA杂交的人工核酸。
    21: 根据权利要求14所述的方法,其中所述药剂另外包含第二部分。
    22: 根据权利要求21所述的方法,其中所述第二部分降解或以化学方式修饰ssDNA,或对所述肿瘤干细胞具有毒性。
    23: 根据权利要求22所述的方法,其中所述第二部分具有放射性。

    说明书


    用于通过靶向肿瘤干细胞的ssDNA复制中间物而抑制肿瘤生长的方法和药剂

        相关申请案的交叉引用

        本申请案主张2007年6月13日申请的美国临时申请案第60/934,420号的权利。以上申请案的全部教导都以引用的方式并入本文中。

        背景技术

        科学家已认识到肿瘤细胞和病理组织结构(诸如畸胎癌)与早期胚胎的细胞和组织的相似性。正常但未分化的胚胎干细胞能够通过未确定的过程形成器官,所述过程在逻辑上必须包括细胞数目的快速增加和分化成器官原基(organanlage)以及随后的器官发生。恶性肿瘤以类似于早期胎儿的速率生长且含有组织学上未分化或已组织化(组织学上出现正常组织)的小环境(niche)。

        肿瘤和胎儿组织似乎共用许多分子和过程。举例来说,细胞表面的复杂抗原性糖胺聚糖,即“癌胚抗原”在胎儿组织与肿瘤中都进行表现,细胞粘附分子也是如此。类似个体发生,肿瘤发生似乎通过一组扩增的干细胞由直系后裔继续进行。仅一小部分来自人类肿瘤的细胞单独或与其它细胞一起具有形成作为免疫抑制啮齿动物中的异种移植物的新肿瘤的能力。限制稀释法异种移植实验已显示,假定肿瘤发生细胞内的一种或一种以上细胞显示类似干细胞的性质,即其能够产生含有其它干细胞的新肿瘤以及再生原始肿瘤中所存在的细胞的表型混合群体。

        肿瘤的单克隆性概念是在20世纪初建立的。近年来,已确定几乎所有形式的晚发性癌症都经过长时期的瘤形成前期(preneoplasia),且这些瘤形成前群落自身是单克隆的并由来自胚胎DNA的一种以上罕见的细胞遗传突变产生。在21世纪初,直接尝试使肿瘤细胞群体富集“干”细胞来进行移植/稀释实验,已证实不仅组织干细胞可能是瘤形成前期的来源,而且肿瘤自身也含有“干”细胞。已提出以下假说的现代重述:肿瘤事实上是适度良好组织化的异质胎儿结构。将预期“癌胚”干细胞的数目会增加且产生使高度异质小环境聚居于肿瘤块中的分化细胞类型。

        整个干细胞领域中所用的各种抗原性标记已用于表面上高度富集能够再生组织或肿瘤的细胞。然而,在这些富集群体中没有细胞显示将其视为干细胞的任何微观形态细胞性质。如果确实肿瘤起源于单一干细胞,那么需要鉴别所述肿瘤且收集其作为足以分析分子和生物化学分析物的干细胞同源群体的方法。首要的是鉴别肿瘤细胞靶标来开发针对选择性抑制瘤形成和瘤形成前期的干细胞的生长或杀死所述干细胞的新颖疗法。

        【发明内容】

        需要干细胞群体中的突变来产生癌症干细胞。来源于19世纪病理学观察结果的现代“肿瘤干细胞”假说假定肿瘤含有具有类似于正常干细胞与胎儿组织两者的性质的独特细胞亚群。这些细胞通过数轮不对称和非有丝分裂的细胞分裂而大量增殖。这种细胞群体可能自我更新且负责大多数肿瘤的生长和维持。因此,普遍相信对肿瘤干细胞分裂的抑制表示有希望相对于目前方法改良功效的新颖治疗性干预。

        本发明是基于指出以下者的观察结果:人类胎儿/幼年生长期与干细胞谱系中的高突变率有关且这种谱系实行先前未检测到的DNA分离和复制模式。先前在美国专利申请案第2006/0063144号和PCT/US06/047136(其教导以引用的方式并入本文中)中描述到肿瘤和胎儿干细胞的特征为称为钟形细胞核的独特细胞核形态型。(钟形细胞核也存在于合胞体中且也应了解,本文所述地本发明方法包涵合胞体以及细胞中存在的钟形细胞核)。含有钟形细胞核的肿瘤和胎儿干细胞在本文中被称为巨核细胞。本发明是基于以下本文所述的最重要观察结果:肿瘤和胎儿干细胞的钟形细胞核经历独特形式的复制。这种独特形式的基因组复制涉及具有其中钟形细胞核分离(如呈“杯与杯(cup-to-cup)”分离形式)的细胞核结构构型的复制中间物,且在分离期间,在基因组复制之前,所述基因组的一大部分首先分离成单链DNA(ssDNA)。这一观察结果与人类细胞分裂的先前观察结果(其中DNA合成通过反复拷贝DNA的短延伸段来进行,随后在有丝分裂时染色单体以双链DNA(double?stranded?DNA,dsDNA)形式聚集浓缩和分离)相反。

        此外,以下观察结果同样重要:在这种独特形式的基因组复制期间,除钟形细胞核内所含的ssDNA外,还可观察到大量ssDNA,这种ssDNA与肿瘤干细胞复制所特有的复制中间物构型相关且指示所述复制中间物构型。重要的是,这些关键观察结果,即在钟形细胞核分裂期间,肿瘤和胎儿干细胞以及合胞体呈其中基因组在一段重要且可利用的时间内在钟形细胞核内或外是实质上单链DNA(ssDNA)的中间物构型,可形成通过检测含有呈复制中间物构型的ssDNA的钟形细胞核或通过检测单独ssDNA来检定抗癌剂和疗法的功效的方法的基础。此外,肿瘤和胎儿干细胞以及合胞体所特有的这种基因组复制的动物(和植物)模型可形成通过靶向这种干细胞复制中间物构型的抑制或破坏来合理地设计新颖癌症疗法的基础。

        举例来说,钟形细胞核内的大量ssDNA以这种独特肿瘤干细胞复制中间物构型存在,可靶向所述ssDNA来进行破坏或降解,从而抑制肿瘤干细胞的生长或致其死亡?;蛘?,也可靶向肿瘤干细胞而非钟形细胞核内所含的ssDNA来进行破坏或降解,从而抑制肿瘤细胞的生长或致其死亡。(如本文中所使用,术语“肿瘤干细胞”和“巨核细胞(metakaryote)”可互换使用且打算包括肿瘤干细胞与胎儿干细胞)。如本文中所使用,无论何时术语“复制中间物”或“复制中间物构型”与ssDNA结合使用,都打算不仅包括钟形细胞核内所含的ssDNA,而且包括钟形细胞核内不含而肿瘤干细胞内所含的ssDNA。因此,举例来说,当本文描述可靶向ssDNA的药剂时,意思是所靶向的ssDNA可含于钟形细胞核内或单独在钟形细胞核的范围外。

        有理由相信其它大分子也以这种复制中间物构型存在(例如,这种复制过程所需的大分子在本文中被称为“肿瘤干细胞特异性分子“且这一术语也包涵“胎儿干细胞特异性分子”和“合胞体特异性分子”),但不一定具体说明)。肿瘤干细胞特异性分子是存在于肿瘤干细胞中、优选地存在于细胞核中且不存在于周围细胞中的分子(例如,本文中也称为巨核细胞所特有的细胞分子)。这些肿瘤干细胞特异性分子(例如结构蛋白、核酸酶等)也可用作新颖抗癌疗法的靶标。

        因此,本发明是针对鉴别特异性抑制肿瘤干细胞的生长/增殖或完全破坏肿瘤干细胞而不使正?;蛭中透上赴谄浞獗栈肪持惺芩鸹蚴芩鸺〉囊┘梁土品ǖ姆椒?,且针对所述药剂的治疗性应用。如本文所述,肿瘤干细胞含有具有独特形态学钟形特征的细胞核,其中在细胞核分裂期间,基因组在一段重要且可利用的时间内实质上是单链DNA(ssDNA)。所述独特的肿瘤干细胞(本文中称为巨核细胞)典型地于特定时间间隔含有包含单链DNA的钟形细胞核。因为经修饰的ssDNA将无法经历进一步复制变回双链DNA(dsDNA),所以通过使用靶向且改变巨核细胞的ssDNA的药剂(例如化学或酶药剂)(例如烷化剂、单链特异性核酸酶、有毒结合物),靶向肿瘤干细胞的细胞核物质来进行破坏。

        本发明还针对鉴别肿瘤干细胞分裂的复制中间物构型所特有的肿瘤干细胞的靶标或标记的方法。所述靶标可例如通过分离含有经历复制的钟形细胞核的肿瘤干细胞,培养所述细胞且使用标准技术收集培养的肿瘤干细胞,并鉴别复制中间物所特有的mRNA、转录物或蛋白质来进行鉴别,其也通过使用所属领域的技术人员所熟知的技术。巨核细胞的分离可根据含有ssDNA的钟形细胞核或细胞核外ssDNA的存在来进行。有理由相信,导致鉴别本文所述的复制中间物所特有的分子的巨核细胞的分离和研究将导致鉴别将适用于抗肿瘤发生疗法的新颖靶标。

        在一个实施例中,本发明描述鉴别与独特钟形细胞核复制中间物构型相互作用的药剂的活体外和活体内方法。所述药剂可例如通过结合、改变肿瘤干细胞内呈复制中间物构型的ssDNA或其它肿瘤干细胞特异性分子、使所述ssDNA或分子不稳定、降解或另外修饰所述ssDNA或分子来抑制或改变肿瘤或肿瘤干细胞生长,由此抑制肿瘤干细胞复制和/或减缓肿瘤生长。具体来说,肿瘤样品(例如来自实体瘤的组织活检)将从受试者获得,具体来说是从实体瘤获得??墒怪琢鲅酚牒蜓∫┘猎诤鲜实纳硖跫?例如保持钟形细胞核复制中间物构型的条件)下接触,且将比较在接触/处理之前和之后肿瘤/肿瘤样品(具体来说是肿瘤干细胞)中钟形细胞核的存在。将通过比较在用候选药剂处理后样品中含有ssDNA的钟形细胞核的数目或单独ssDNA的量、在处理前样品中含有ssDNA的钟形细胞核的数目或单独ssDNA的量、与模拟处理的对照样品中含有ssDNA的钟形细胞核的数目或单独ssDNA的量,来确定抑制肿瘤生长的药剂。钟形细胞核内或钟形细胞核外ssDNA的量可通过例如吖啶橙染色来定性地确定,或可使用标准技术确定定量的量。所处理的肿瘤或肿瘤干细胞中含有ssDNA的钟形细胞核的数目减少或含有ssDNA的钟形细胞核不存在(或单独ssDNA的量减少或不存在)表示所关注的药剂有效靶向ssDNA且抑制肿瘤干细胞生长或杀死肿瘤干细胞。也可检定钟形细胞核复制中间物是否存在。

        在另一个实施例中,通过给动物注射癌症异种移植物来形成异质动物模型。适合用于活体内检定方法的动物为所属领域的技术人员所知,且可对待评估的特定肿瘤类型具有特异性。举例来说,诸如小鼠和大鼠等啮齿动物通常用于实体瘤分析。所述方法包含将异种移植物移植到动物中,使所述异种移植物长成实体瘤,用候选药剂/疗法处理测试动物(且使所述肿瘤与所述候选药剂/疗法接触),切除肿瘤和与对照动物(例如未用候选药剂处理的动物)相比,分析肿瘤组织中是否存在含有ssDNA的钟形细胞核复制中间物或单独ssDNA。美国专利申请案第2006/0063144号中所揭示的程序可用于鉴别钟形细胞核结构。此外,根据PCT/US06/047136中所揭示的程序,可鉴别钟形细胞核内或外的ssDNA。举例来说,可用已知结合、修饰、改变或降解ssDNA(优先于细胞中存在的双链DNA)的药剂(诸如烷化剂、ssDNA核酸酶、其它酶或蛋白质)处理测试动物。不同于基于相对于对照组生长肿瘤的收缩或异种移植动物的存活模式来关注药剂的活性的典型肿瘤模型,这一策略涉及评估生长的异种移植物中ssDNA染色的巨核细胞或ssDNA是否存在或其减少。

        举例来说,所关注的药剂(本文中也称为候选药剂)是相对于对照组显著减少吖啶橙染色的巨核细胞数目的药剂。(吖啶橙使单链DNA染色且发出红色荧光,而在合适的条件下双链DNA发出绿色荧光)。在另一个实施例中,防止DNA再退火的药剂是单独使用或与破坏或降解ssDNA的药剂一起使用。本发明的检定模型靶向巨核细胞过程且因此鉴别用于治疗未用靶向快速分裂的有丝分裂肿瘤细胞的标准药剂治疗的残余表面肿瘤而非肿瘤主体的药剂。

        在其它实施例中,方法是针对治疗选择性抑制肿瘤干细胞,而不会实质上防止或抑制周围细胞(例如维持型干细胞)的生长。举例来说,虽然所靶向的干细胞正经历细胞核分裂,但所述方法包含使所述细胞与能够进入细胞核且通过修饰或改变ssDNA来修饰或改变钟形细胞核复制中间物构型的药剂接触,从而防止所靶向的细胞内钟形细胞核的进一步细胞核分裂且/或破坏细胞。也可在细胞内靶向肿瘤干细胞特异性分子,由此靶向和破坏肿瘤干细胞特异性分子的功能或活性,从而防止或抑制肿瘤细胞生长。在特定实施例中,所述药剂是化学药剂、放射药剂、酶、或放射治疗,由此靶向钟形细胞核复制中间物。

        基于本文中所提供的资料,有理由相信癌发生似乎是连续过程,其中某些胎儿/幼年干细胞突变,故其在整个成年寿命中继续以幼年干细胞形式生长且获得所述额外变化以形成快速生长(胎儿速率)和死亡的瘤性干细胞。以下教导是基于对人类胎儿、瘤形成前和瘤性病变的钟形细胞核内的独特且主要复制中间物的认识:呈先前未识别的干细胞DNA复制和分离形式的ssDNA、或所述独特复制过程也需要的干细胞特异性分子,构成旨在杀死人类瘤形成和瘤形成前期的干细胞或减缓其生长的疗法的新颖有价值靶标。

        【附图说明】

        图1是关键影像的概述。A)人类胎儿肠、正常结肠粘膜、腺瘤和腺癌中的间期和早前期(E.P.)细胞内所观察到的细胞核形态型的实例。B)胎儿肠的钟形细胞核的高分辨率影像(1400倍)。聚集浓缩的DNA似乎形成维持空心钟结构的开口的圆环。比例尺是5μm。

        图2A和2B是5-7周的胚胎肠的影像。图2A:相差像(左画面)和染色的细胞核影像(中)和合并的影像(右)展示约50微米直径管状合胞体中的细胞核的线性阵列。图2B:细胞核的高分辨率影像展示空心钟形结构。在所观察的所有胚管中都保持钟形物的“头脚”定向,但管来回蛇形延伸,使得平行管可具有局部反平行钟形细胞核定向。比例尺在低放大率下是50μm且在高放大率下是5μm。

        图3A-3D展示胎儿肠中的钟形细胞核的细胞核分裂的影像。图3A和3B:对称细胞核分裂。钟形细胞核从类似形状的钟形细胞核中显现出来。图3C和3D:不对称细胞核分裂。球形细胞核和“雪茄”状细胞核从钟形细胞核中显现出来。比例尺是5μm。

        图4A-4C展示正常成人结肠隐窝的影像。图4A:约2000个类球形、球形或盘状细胞核的隐窝偶尔(<1/100)含有位于隐窝底部的可识别的钟形细胞核(箭头)。图4B:展示另一个钟形细胞核的隐窝底部。图4C:充分分散的隐窝中的壁和内腔表面的间期和有丝分裂细胞核的形态型。放大影像展示:(i)球形和卵形间期细胞核,(ii、iii)球形和卵形细胞核的早前期,和(iv)后期(anatelophase)细胞核。比例尺对于低放大率影像是100μm且对于高放大率影像是5μm。

        图5A-5E展示腺瘤的影像。图5A:腺瘤的特征性大分枝隐窝。图5B:存在于整个腺瘤中的不规则隐窝样结构。通常2个、但有时1个、4个或甚至8个钟形细胞核(插图)出现在这些大的(>4000个细胞)不规则隐窝样结构的底部。图5C:一群含有1个钟形细胞核的具有类似细胞核形态型的细胞。这些形式的群含有正好总共16个、32个、64个和128个细胞。左图是福尔根-吉姆萨染色(Feulgen-Giemsa?stain)。右图是相差自体荧光影像。图5D:钟形细胞核出现在腺瘤中的背景:(i)具有31个卵形细胞核和1个钟形细胞核的群,(ii)并肩排列的多个钟形细胞核,(iii)以并排模式排列的钟形细胞核(箭头)(iii)。约250个细胞核(其中数个钟形细胞核表示初生隐窝底部)的不规则混合物。图5E:含有5种不同细胞核形态型的细胞的明显克隆膜片的不规则隐窝样结构,其中1个钟形细胞核(箭头)位于底部。比例尺是100μm(在“a、b”中)和5μm(在“e”中)。

        图6A-6E展示腺癌的影像。图6A:具有分枝和频繁断点的极大隐窝样结构(>8000个细胞)。箭头表示主要存在于肿瘤表面附近的约250个细胞隐窝样结构的实例。图6B:具有多个钟形细胞核(所有细胞核形态型的约3%)。的内部肿瘤块图6C:以头脚合胞体和非合胞体并排构型定向的图6B中的钟形细胞核。图6D:腺癌中的对称细胞核分裂。图6E:腺癌中的钟形物的不对称细胞核分裂,从而形成雪茄状细胞核。已在肝的结肠转移瘤中观察到类似结构。比例尺是5μm。

        图7A-7D说明人类组织和细胞的研究中的定量影像细胞计量术的阶段。图7A:准备进行固定的新鲜结肠手术丢弃物。图7B:展现通过息肉的1mm切片的分散结果的显微镜载玻片制备物(描绘息肉的“上下”定位的轮廓)。图7C:整个隐窝都可观察到的细胞核分散(呈洋红色)。与以上所示的5μ切片(BrdU染色和H&M染色)相比,保留所有隐窝细胞核。图7D:电动Axioscop显微镜-AxioCam彩色CCD相机-KS?400软件影像分析工作站。

        图8A和8B说明在应用FISH以研究肿瘤中的不分裂和分裂钟形细胞核中的“所关注的靶标”。图8A:染色质(由于每平方微米的DNA含量较高,所以染色较深)形成类似于以2个平行圆圈排列的前期染色体的独特结构。置于附图中的这些圆圈说明特定染色体可能存在于钟形细胞核的这一特定位点的预测。图8B:在钟形细胞核的整个不对称分裂中发生的呈假想转变(这里是钟形细胞核变成卵形细胞核)的染色质分布和特定染色体定位变化。

        图9A-9D是说明TK-6人类细胞的球形细胞核内的染色体11的荧光原位杂交结果的影像。图9A:处于前期染色体分散的两对染色体。图9B:球形细胞核DAPI细胞核染色。图9C:与FITC荧光探针杂交的同一对染色体。图9D:DAPI与FITC间期染色体染色的合并影像。比例尺是5微米。

        图10展示排列在合胞体中的钟形细胞核的对称细胞核分裂的影像。

        图11展示描绘DNA在正经历细胞核分裂的钟形细胞核中的定位的影像。

        图12展示在钟形细胞核的细胞核分裂期间细胞核物质的排列和组成(ssDNA或dsDNA)。

        图13A-13D展示人类胎儿制备物的影像,其描绘一系列先前未识别的细胞核形式。这些形式产生原始钟形细胞核。图13A展示呈围绕球形或略微卵形细胞核的长轴的“带“形式的具有聚集浓缩约10%的总DNA含量的细胞核。图13B展示其中2个聚集浓缩的细胞核“带”似乎已分离、但仍然是单个细胞核的一部分的细胞核。图13C展示似乎已通过图13B的双带状细胞核的分裂而产生的一对细胞核。图13D展示每一个合胞体都含有一组钟形物,其中如图13C中,单一一对钟形物在其直线中点处以开口相对。这些影像展示一系列对称分裂形成从中心对推开的细胞核。

        图14A和14B展示结肠腺瘤(图14A)和腺癌(图14B)中的细胞核形态型。癌发生的形态型展示类似的带,一个或两个带围绕卵形细胞核的长轴。

        图15A-15C展示对人类着丝粒具有特异性的FISH染色。图15展示来自人类12周胎儿结肠组织的球形(图15A)、雪茄状(图15B)和钟形(图15C)细胞核内的着丝粒(亮色)。

        图16展示由人类胎儿心肌(妊娠约12周)中的钟形细胞核产生的多核合胞体。特定方法涉及酶组织解离,随后吖啶橙染色和荧光显微术。

        图17展示分裂的钟形细胞核内的DNA合成的进展。DNA含量的增加在影像上方指出且在下方用图表绘图。所述影像由高分辨率(每个像素1000bp.)福尔根DNA影像细胞计量术捕捉。

        图18A-18B展示利用ssDNA中间物的钟形细胞核的复制中间物构型。图18A展示钟形细胞核的对称分裂且指出DNA含量的相应增加。图18B展示钟形细胞核的吖啶橙染色。所述吖啶橙染色的红色荧光指示存在ssDNA中间物。相邻细胞内的双链DNA由吖啶橙染色的绿色荧光指示。

        图19展示用于合理治疗性设计的定位肿瘤干细胞、形成均质样品、且鉴别对所述干细胞具有特异性的靶标大分子的方法的流程图。

        图20A-20F展示由吖啶橙和ssDNA抗体染色的钟形细胞核内ssDNA中间物图案的并排比较。

        【具体实施方式】

        本发明涉及以下发现:肿瘤干细胞(例如分裂产生肿瘤的细胞)的特征为钟形细胞核且经历独特形式的复制。钟形细胞核很少存在于成人组织中,或以大量降低的数目存在,但肿瘤组织经历基因组以单链DNA(ssDNA)呈现的时间段。在结肠和胰腺人类肿瘤中,钟形细胞核通过非有丝分裂过程对称和不对称地分裂(格思杰伐(Gostjeva)等人,癌症遗传学和细胞遗传学(CancerGenetics?and?Cytogenetics),164:16-24(2006);格思杰伐(Gostjeva)等人,干细胞评论(Stem?Cell?Reviews),1:243-252(2005))。这些钟形细胞核大量地出现在5-7周胚胎后肠(其中,其被包裹于管状合胞体中且占例如所有细胞核的30%)和肿瘤组织(其中,其大量存在于“未分化的”小环境中)中。其具有数个类似干细胞的品质,尤其是不对称分裂的“口令”和与人类结肠瘤形成前和瘤性组织的生长速率一致的细胞核分裂频率(赫蕾诺-希门尼斯(Herrero-Jimenez,P.)等人,突变研究(Mutat.Res.),400:553-78(1998),赫蕾诺-希门尼斯(Herrero-Jiminez,P.)等人,突变研究(Mut.Res.)447:73-116(2000);格思杰伐(Gostjeva)等人,癌症遗传学和细胞遗传学(Cancer?Geneticsand?Cytogenetics),164:16-24(2006);格思杰伐(Gostjeva)等人,干细胞评论(Stem?Cell?Reviews),1:243-252(2005))。这些先前未识别的细胞核形式都是肿瘤产生和分化的来源且因此为癌症治疗策略的靶标。这些钟形细胞核经历基因组实质上以ssDNA呈现的阶段的观察结果允许靶向和破坏所述细胞核。

        鉴别抗肿瘤发生药剂的方法

        本文所述的出乎意料的观察结果是,肿瘤干细胞复制涉及复制中间物构型,其中钟形细胞核开始分离成两个细胞核,且在细胞核分离期间,肿瘤干细胞基因组中的大部分首先分离成ssDNA。在这种复制中间物构型期间,大量ssDNA存在于细胞核和细胞中,可使用常规方法进行检测。这一观察结果构成筛选和鉴别本文所述的有效抗肿瘤发生药剂的方法的基础,所述方法评估所述药剂抑制/防止钟形细胞核增殖的适用性。此外,在这种复制中间物构型期间,肿瘤干细胞特异性分子也可存在于细胞中且也可用作检定方法的基础。使用本文和美国专利申请案2006/0063144和PCT/US06/047136(各案的教导都以全文引用的方式并入本文中)中所述的方法,可在接触候选抗肿瘤发生药剂或用所述药剂处理之前和之后,使实体瘤块中含有ssDNA的钟形细胞核或单独ssDNA显像,且比较在用候选/测试药剂处理之前和之后具有钟形细胞核(巨核细胞)的细胞的相对密度,或与并未接触所述药剂/用所述药剂处理的其它肿瘤组织作比较。相对密度(例如,相对于细胞数目或相对于肿瘤块重量,含有ssDNA的钟形细胞核或单独ssDNA的数目)降低将表示药剂有效减少或防止肿瘤干细胞增殖。

        举例来说,在已确定整个或一部分肿瘤样品(例如从患者获得,或从作为宿主生物体中的异种移植物形成的实体瘤获得)中含有ssDNA的钟形细胞核的相对密度后,基于钟形细胞核不对称分裂时存在的ssDNA中间物构型,使肿瘤样品接触抗肿瘤发生药剂,例如靶向ssDNA且降解ssDNA、防止ssDNA退火或防止ssDNA模板复制等的药剂。接触药剂后,可再次确定钟形细胞核的相对密度。如果含有ssDNA的密度降低或完全不存在,那么将有理由相信候选药剂将是有效抗肿瘤发生药剂。

        更具体来说,本文描述一种鉴别抑制肿瘤生长的药剂的方法,其包含使受试者或宿主动物的肿瘤样品与候选药剂接触,其中所述肿瘤样品包含含有含ssDNA的钟形细胞核或单独ssDNA的肿瘤干细胞,且其中所述钟形细胞核的一些或全部呈复制中间物构型;保持所述样品与所述候选药剂在适合所述药剂与ssDNA相互作用的条件下接触;确定在接触后肿瘤样品中含有ssDNA的钟形细胞核或单独ssDNA的存在、不存在或数目;和比较在与候选药剂接触后样品中含有ssDNA的钟形细胞核或单独ssDNA的存在、不存在或数目与对照样品中含有ssDNA的钟形细胞核或单独ssDNA的存在、不存在或数目。确定在与候选药剂接触后样品中含有ssDNA的钟形细胞核的数目减少或不存在或ssDNA减少或不存在表示所述药剂抑制肿瘤生长。

        或者,钟形细胞核的存在、不存在或数目可通过检测呈复制中间物构型或极接近复制中间物构型的一种或一种以上肿瘤干细胞特异性分子的存在来确定。此外,可使用本发明方法来检测对钟形细胞核的复制中间物构型具有特异性的所述大分子。因为肿瘤干细胞的钟形细胞核表示不存在于其它人类细胞中的事件,所以鉴别这些分子有助于鉴别用于治疗性药物设计的靶标。此外,因为肿瘤干细胞中的大部分DNA在复制期间是单链,所以在对称分裂过程中的干细胞可由所属领域的技术人员分离用于鉴别大分子??赡苡敫粗浦屑湮锕剐陀泄氐那痹诖蠓肿拥氖道ǎ簊sDNA结合蛋白,诸如异质细胞核核糖核蛋白;与ssDNA的物理移动和分离有关的染色体结构维持(structural?maintenanceof?chromosome,SMC)蛋白;新颖着丝粒蛋白;与DNA修复有关的酶;新颖聚合酶;和一系列尚未鉴别的蛋白。

        在一个特定实施例中,可通过给动物注射癌症异种移植物来形成合适的异质动物模型。所述异种移植物随后将长成实体瘤,随后可切除。具有钟形细胞核的细胞、巨核细胞或具有钟形细胞核的合胞体的存在可如本文和PCT/US06/047136中所述来确认。随后可使动物和/或肿瘤接触已知防止ssDNA的再退火、结合、修饰或降解ssDNA的靶向ssDNA的药剂,例如烷化剂、ssDNA核酸酶或其它酶或蛋白质,包括例如抗体、寡核苷酸、核糖核酸酶、核糖蛋白或融合蛋白等药剂。一些非限制性实例包括卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)。

        不同于基于相对于对照组生长肿瘤的收缩或异种移植动物的存活模式来关注药剂活性的其它肿瘤模型,这一策略涉及评估生长的异种移植物中ssDNA染色的巨核细胞的出现率。所关注的药剂是相对于对照组(例如,和未经处理的肿瘤样品或在接触所述药剂前相同肿瘤样品的一部分或全部)显著减少例如吖啶橙染色的巨核细胞的数目的药剂。有理由相信,预期干扰分裂肿瘤细胞的ssDNA复制中间物的药剂/化合物靶向巨核细胞过程,且因此是有效治疗未用靶向快速分裂的有丝分裂肿瘤细胞的标准药剂处理的残余表面肿瘤而非肿瘤主体的药剂。所属领域的技术人员将仅需要关注钟形细胞核的ssDNA、巨核细胞内的ssDNA的数量或品质所发生的变化,以及钟形细胞和肿瘤自身所发生的任何形态变化,以确定候选药剂(或所关注的药剂)是否将是用于进一步评估的可行候选物。具体来说,肿瘤干细胞形态的变化、巨核细胞内ssDNA的量的变化或肿瘤自身的形态可表示候选药剂有效抑制肿瘤生长。所述变化将通过肿瘤干细胞的减少或不存在来表现。

        癌症治疗学中的“干细胞靶标“

        由于本文所提供的资料,方法现可用于传递药剂以靶向和破坏肿瘤干细胞而不使细胞在其封闭环境中受损或受损极小。在本发明的一个实施例中,方法可用于通过给药ssDNA特异性药剂或靶向肿瘤干细胞特异性分子的药剂来治疗受试者的瘤形成前期、瘤形成(癌瘤)或其它病理。如本文中所使用,术语“治疗”可指改善与癌瘤或病理相关的症状;减少、防止或延缓癌瘤的转移;减少一种或一种以上肿瘤的数目、减小其体积和/或尺寸;和/或降低癌瘤或病理的症状的严重程度、缩短其持续时间或降低其出现率。如本文中所使用,“ssDNA特异性治疗剂”是指靶向肿瘤干细胞的ssDNA以通过防止ssDNA形成、干扰ssDNA复制或干扰ssDNA拷贝来进行破坏的药剂(例如化学治疗剂),或另外治疗受试者的癌瘤或减少或消除肿瘤或病理的作用的药剂。如本文所述,ssDNA在肿瘤干细胞维持中很重要,因此破坏ssDNA会防止ssDNA形成、干扰ssDNA复制或干扰ssDNA拷贝,从而将抑制肿瘤干细胞复制且由此治疗癌瘤或病理。在一些实施例中,所述的治疗方法是与手术、激素切除疗法、放射疗法或化学疗法中的一者或一者以上结合使用?;е瘟萍?、激素药剂和/或放射治疗剂和本发明化合物可同时、分开或依次给药。

        在一个实施例中,因为经修饰的ssDNA将不会经历进一步复制变回双链DNA(dsDNA),所以可利用靶向且改变ssDNA的化学药剂或酶药剂(例如烷化剂、单链特异性核酸酶、靶向复制机构的药剂等)来靶向肿瘤干细胞的细胞核物质进行破坏。因为ssDNA在分裂肿瘤干细胞的异型细胞核形态型中比在相邻细胞中显著更丰富,所以通过使用特异性靶向ssDNA的药剂来实现特异性肿瘤细胞抑制。举例来说,任何防止ssDNA复制的药剂(例如与DNA杂交的分子)都不能延长,例如经修饰的寡核苷酸或核酸衍生物,例如缺乏延长所必需的γ-磷酸酯的核酸或肽核酸。本发明是针对一种通过特异性靶向癌性肿瘤中的肿瘤干细胞的ssDNA来治疗性治疗具有所述肿瘤的患者的方法,其中所述方法包含向所述患者给药治疗有效量的特异性结合单链DNA且破坏肿瘤干细胞的烷化剂、DNA核酸酶、DNA结合多肽、寡核苷酸或小有机分子,由此有效治疗性治疗肿瘤。多肽、寡核苷酸或寡肽可视情况结合生长抑制剂或细胞毒性剂、放射性同位素、溶核酶等。此项技术中已知将药剂传递到患者的细胞或肿瘤组织的方法,其中所述药剂将破坏或防止ssDNA基因组复制,且由此防止肿瘤干细胞增殖。

        在本发明方法中,利用特异性结合ssDNA的药剂或部分以肿瘤干细胞特异性方式传递药剂。本文中所使用的术语“特异性结合”ssDNA的药剂是优先或选择性结合ssDNA而非dsDNA的药剂。虽然在特异性结合ssDNA与双链DNA的药剂之间会发生某种程度的非特异性相互作用,但如通过完整或部分地特异性识别ssDNA所介导,可区分特异性结合。特异性结合通常将通过肿瘤干细胞中ssDNA的相对丰度来证实。

        本发明的另一个实施例特异性靶向肿瘤干细胞的ssDNA。ssDNA可能不存在于细胞核中,或可能结合到核蛋白复合物中。ssDNA以所属领域的技术人员将能够用于进行特异性靶向的独特结构构型存在。举例来说,热力学证实形成十字形结构和发夹环。在本发明的一个特定实施例中,可利用抗体特异性靶向这些结构?!翱固濉笆峭ü钐逋饣蚧钐迥诓逡悍从λ竦玫拿庖咔虻鞍追肿?,且包括多克隆和单克隆抗体。所述术语也包括遗传工程改造形式,诸如嵌合抗体(例如人源化鼠源抗体)、异源偶联抗体(例如双特异性抗体)和重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”也包括抗体的抗原结合片段,诸如Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG和反向IgG,以及重链可变区和轻链可变区。与ssDNA产生的抗体免疫反应性可在活体内产生,或通过诸如在噬菌体或类似载体中选择重组抗体库等重组方法产生。参见例如,豪思(Huse)等人(1989)科学(Science)246:1275-1281;和沃德(Ward)等人(1989)自然(Nature)341:544-546;和沃恩(Vaughan)等人(1996)Nature?Biotechnology,14:309-314?!翱乖岷掀巍卑ń岷蟬sDNA的抗体的任何部分??乖岷掀慰衫缥–DR区域的多肽或免疫球蛋白分子中保留对ssDNA的亲和力和特异性的其它片段。许多ssDNA抗体是市售的。在一个特定实例中,所属领域的技术人员可鉴别ssDNA结合抗体的单链Fv片段,其是仍保留全长亲本抗体的特异性和单价结合亲和力的最小抗体形式。单链Fv片段是表达为单个基因且可与细胞核定位信号融合以将抗体片段导向细胞核。有理由相信,可通过显微注射或病毒介导的基因疗法在肿瘤细胞群中引入单链Fv片段并使其表达。一旦结合ssDNA的丰富二级结构,抗体片段就会阻断肿瘤干细胞的复制和分裂。

        在另一个实施例中,所属领域的技术人员可在活体外利用熟知方法表达并纯化具有已知特异性ssDNA结合域的多肽。举例来说,polyADP核糖聚合酶(polyADP?Ribose?Polymerase,PARP)或异质细胞核核糖核蛋白家族的ssDNA特异性域可通过杆状病毒或其它真核蛋白表达系统进行表达。这些药剂可以进一步与阳离子细胞穿透肽序列框内融合,从而促进生物活性肽的快速细胞摄取?;蛘?,可利用显微注射将多肽引入细胞中。

        在又一个实施例中,将阳离子氨基磷酸酯寡核苷酸引入肿瘤干细胞中以高效地靶向单链DNA。所属领域的技术人员可以如下方式制造这些药剂:所述药剂将充分且随机地靶向ssDNA的多个区域。这些药剂以高亲和力结合ssDNA且易于进入靶标细胞中而无需载体处理(vectorization)或化学转染。

        在另一个实施例中,可通过化学药剂特异性靶向ssDNA。这些药剂优先以序列或二级结构依赖性方式与ssDNA核苷酸碱基反应。实例包括下表1中所列的放线菌素D(Actinomycin?D)、高锰酸钾、溴乙醛、氯乙醛、焦碳酸二乙酯和四氧化锇。尽管这些物质中的一些在高含量下有毒,但有理由相信可以局部和剂量选择性方式将所述药剂引入肿瘤中,由此使毒性最小。同样,尽管一些化学药剂结合ssDNA与双链DNA,但肿瘤干细胞中丰富含量的ssDNA有助于极低和更有效的治疗剂量。

        ??化学药剂??机制??放线菌素D??充分研究的抗肿瘤药剂。结合ssDNA中丰富的发夹DNA结构。??溴乙醛??在腺嘌呤和胞嘧啶的碱基配对位置处发生反应。优先与单链环和十字形中的??碱基反应。??氯乙醛??易于与ssDNA相互作用以主要形成乙烯桥损坏的氯乙烯代谢物。??焦碳酸二乙酯??使嘌呤在N-7位置处羧乙基化,从而打开咪唑环。实质上反应性朝向DNA??的单链区域。??四氧化锇??在吡啶存在下添加到嘧啶的C-5、C-6双键处以形成锇酸酯。实质上与ssDNA??的反应性大于与双链DNA的反应性。??高锰酸钾??具有嘧啶特异性和单链特异性。通过氧化修饰碱基。

        表1:结合ssDNA的化学药剂。

        在另一个实施例中,ssDNA治疗剂包含活性剂组分/部分和靶向剂组分/部分。所述靶向剂组分是如上文所述特异性结合ssDNA的药剂,或包含所述药剂。靶向剂组分连接于所述活性剂组分上。举例来说,其可直接彼此共价结合。当两者通过共价键彼此直接结合时,所述键可通过由每一部分上的活性基团形成合适的共价连接而形成。举例来说,另一方面,一种化合物上的酸基可与胺、酸或醇缩合以分别形成相应酰胺、酸酐或酯。除羧酸基团、氨基和羟基外,其它适合在靶向剂组分与活性剂组分之间形成连接的活性基团包括磺?;?、氢硫基和羧酸的卤酸(haloic?acid)和酸酐衍生物。

        在另一个实施例中,治疗剂可包含两种或两种以上部分或组分,通常是靶向剂部分和一种或一种以上活性剂部分??墒褂昧踊爬戳踊钚约劣氚邢蚣磷榉?,其中靶向剂与ssDNA或肿瘤干细胞特异性分子特异性相互作用,由此将活性剂传递到复制中间物构型,且抑制钟形细胞核的进一步复制。

        连接于靶向剂组分上的活性剂组分可为任何实现所需治疗结果的药剂或包含所述药剂,所述药剂包括诸如以下药剂:放射性核素(例如I125、123、124、131或其它放射性药剂);化学治疗剂(例如抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂);免疫刺激剂(例如细胞因子);抗肿瘤剂:消炎剂;促细胞凋亡剂(例如肽);毒素(例如蓖麻毒素、肠毒素、LPS);抗生素;激素;蛋白(例如表面活性剂蛋白、凝结蛋白);溶解剂;小分子(例如无机小分子、有机小分子、小分子的衍生物、复合小分子);纳米粒子(例如基于脂质或非脂质的调配物);脂质;脂蛋白;脂肽;脂质体;脂质衍生物;天然配体;发生改变的蛋白(例如经修饰以增加对ssDNA的亲和力的基于白蛋白或其它血液载体蛋白的传递系统,或膜联蛋白A1的衍生物,即血清类粘蛋白);溶核酶;抑制肿瘤干细胞的生长、迁移的药剂;基因或核酸(例如反义寡核苷酸);病毒或非病毒基因传递载体或系统;或前药或前分子(promolecule)。所属领域的技术人员将熟悉活性剂的设计和应用。

        举例来说,在一个实施例中,放射性核素或其它放射性药剂可用作活性剂组分。靶向剂组分以肿瘤特异性方式传递放射性药剂,允许局部放射损伤且在整个肿瘤中(包括在肿瘤的肿瘤细胞、基质细胞和内皮细胞中)引起放射诱发的细胞凋亡和坏死。

        在另一个特定实施例中,用于瘤性疾病的化学治疗剂可用作活性剂组分。代表性药剂包括烷化剂(氮芥、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)和其它类似药剂。举例来说,在某些实施例中,化学治疗剂可为细胞毒性或细胞抑制药物?;е瘟萍烈部砂ǘ韵赴哂衅渌饔?诸如将干细胞状态逆转为分化状态)或抑制细胞复制的化学治疗剂。适用于本发明的已知细胞毒性剂的实例例如列于古德曼(Goodman)等人,“治疗学的药理学基础(ThePharmacological?Basis?of?Therapeutics),”第6版,吉尔曼(A.G.Gilman)等人编/纽约麦克米兰出版公司(Macmillan?Publishing?Co.New?York),1980中。下表2中展示一些实例。

        ??氮芥类似物??烷基磺酸盐?乙烯亚胺??亚硝基脲??三嗪??环磷酰胺??白消安??(Busulfan)?塞替派?(Thiotepa)??卡莫司汀??丙卡巴肼??(Procarbazine)??苯丁酸氮芥??曲奥舒凡??(Treosulfan)?三亚胺醌?(Triaziquone)??洛莫司汀??氮烯唑胺??(Dacarbazine)??美法仑(Melphalan)??甘露舒凡??(Manosulfan)?卡巴醌?(Carboquone)??司莫司汀??(Semustine)??氮芥(Chlormethine)??美法仑??链脲霉素??(Streptozocin)??异环磷酰胺??福莫司汀??(Fotemustine)

        ??氮芥类似物??烷基磺酸盐?乙烯亚胺??亚硝基脲??三嗪??氯乙环磷酰胺??(Trofosfamide)??尼莫司汀??(Nimustine)??泼尼莫司汀??(Prednimustine)??雷诺莫司汀??(Ranimustine)??二氯甲二乙胺??(Mechlorethamine)

        表2:化学治疗剂。

        其它细胞毒性剂包括长春花生物碱,诸如长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine);酶,诸如L-天冬酰胺酶;铂配位络合物,诸如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin);经取代的脲,诸如羟基脲;和甲基肼衍生物,诸如丙卡巴肼。因为ssDNA相较双链DNA提供更多的潜在烷基化靶标,所以本文所述的方法表示改良公知化学治疗性DNA烷化剂的功效的方法。公知化学治疗方案的显著缺点包括非特异性和不良副作用。在选择性靶向有限的易受损肿瘤细胞群体中的ssDNA的情况下,有理由相信为改良功效,可重新计算给药方案。

        目前用于治疗癌症的大部分化学治疗剂具有能够直接与靶向剂组分的胺或羧基化学交联的官能团。举例来说,可利用顺铂上的游离氨基,同时可利用美法仑和苯丁酸氮芥上的游离羧酸基团。这些官能团(即游离氨基和羧酸)为各种同双官能和杂双官能化学交联剂的靶标,其可使这些药物直接与游离氨基交联。

        具体来说,本发明涵盖靶向剂组分和/或活性剂组分包含用于螯合金属的螯合物部分(例如用于放射金属或顺磁离子的螯合剂)的实施例。在优选实施例中,所述螯合剂是用于放射性核素的螯合剂。适用于本发明的放射性核素包括γ发射体、正电子发射体、奥格电子(Auger?electron)发射体、X射线发射体和荧光发射体,其中β或α发射体优选用于治疗用途。在放射疗法中适用作毒素的放射性核素的实例包括:32P、33P、43K、47Sc、52Fe、57Co、64Cu、67Ga、67Cu、68Ga、71Ge、75Br、76Br、77Br、77As、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、90Y、97Ru、99Tc、100Pd、101Rh、103Pb、105Rh、109Pd、111Ag、111In、113In、119Sb、121Sn、123I、125I、127Cs、128Ba、129Cs、131I、131Cs、143Pr、153Sm、161Tb、166Ho、169Eu、177Lu、186Re、188Re、189Re、191Os、193Pt、194Ir、197Hg、199Au、203Pb、211At、212Pb、212Bi和213Bi。优选治疗性放射性核素包括188Re、186Re、203Pb、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、77Br、211At、97Ru、105Rh、198Au和199Ag、166Ho或177Lu。螯合剂将与金属配位的条件例如由甘瑟(Gansow)等人的美国专利第4,831,175号、第4,454,106号和第4,472,509号描述。

        99mTc是对这一应用尤其具有吸引力的放射性同位素,因为其易于用于所有细胞核医学部门,便宜,给与极少患者放射剂量,且可容易通过肼基烟酰胺部分拴住DNA寡核苷酸。(参见例如,那拓维驰(Hnatowich)等人,细胞核医学杂志(J.of?Nuclear?Med.),36:2306-2314(1995))。选择无规DNA寡聚物可经锝标记且将结合肿瘤干细胞的ssDNA中的可接近且丰富的相应序列。99mTc具有6小时的半衰期,这个意思是需要快速靶向标记锝的寡聚物。因此,在某些实施例中,治疗剂包括用于锝的螯合剂。

        治疗剂也可包含放射致敏剂,例如增加细胞对放射的敏感性的部分。放射致敏剂的实例包括硝基咪唑、甲硝哒唑(metronidazole)和米索硝唑(misonidazole)(参见例如,迪芬达(DeVita,V.T.Jr.),哈里森内科学原理(Harrison′s?Principles?of?Internal?Medicine),第68页,纽约麦克劳希尔图书公司(McGraw-Hill?Book?Co.,N.Y.),1983,其以引用的方式并入本文中)。给药包含放射致敏剂作为活性部分的ssDNA治疗剂且使其定位于发生转移的细胞处。使个体暴露于放射后,放射致敏剂被“激发”且导致细胞死亡。

        存在各种可用作螯合配体且可作为ssDNA治疗剂的一部分衍生的部分。举例来说,所述螯合配体可为1,4,7,10-四氮环十二烷四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙三胺五乙酸(DTPA)和1-对异硫氰基-苯甲基-甲基-二亚乙三胺五乙酸(ITC-MX)的衍生物。这些螯合剂通常在侧链上具有基团,螯合剂可通过所述基团用于连接靶向剂组分。所述基团包括例如苯甲基异硫氰酸酯,DOTA、DTPA或EDTA可通过苯甲基异硫氰酸酯与例如抑制剂的氨基偶合。

        在另一个特定实施例中,本发明包括ssDNA特异性溶核酶用于破坏肿瘤细胞的ssDNA的用途。举例来说,脱氧核糖核酸酶VI、S1核酸酶、RAD2或对ssDNA具有特异性的任何其它人类核酸内切酶可通过病毒介导的基因表达或显微注射而在肿瘤块中异位表达。所属领域的技术人员将熟悉这些熟知方法。因为肿瘤干细胞具有与相邻细胞相比实质上提高含量的ssDNA,所以核酸酶将对肿瘤干细胞具有增强的细胞毒性作用。在一个类似实施例中,所属领域的技术人员可工程改造催化性RNA分子(核糖酶)以使ssDNA的不受阻碍和未受?;さ暮塑账嶂髁淳芮缀诵怨セ?。举例来说,单链DNA分子在生理条件下的特定裂解可通过具有脱氧核糖核酸酶活性的催化性RNA分子来实现。一个特定实例是具有核糖具有亲核性2′羟基的5′端核苷酸的核糖核苷酸聚合物。在又一个实施例中,可靶向肿瘤干细胞的编码ssDNA特异性胞苷脱氨酶的APOBEC3G基因以使ssDNA高突变,由此限制复制。所属领域的技术人员将熟悉建构APOBEC3G表达载体且将其传递到靶标细胞的方法。

        药剂的传递

        在本发明方法中,药剂可单独给药,或以包含药剂和生理学上相容的载剂或赋形剂的组合物(例如医药或生理组合物)形式给药。在本发明的一个实施例中,其可在活体内(例如向个体)或活体外(例如向组织样品)给药。本发明方法不仅可用于人类个体,而且还可用于兽医用途(例如用于其它哺乳动物,包括驯养动物(例如马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、鸟)和非驯养动物。所述载剂和组合物可为无菌的。调配物应适合给药方式。

        合适的医药学上可接受的载剂包括(但不限于)水、盐溶液(例如NaCl)、生理盐水、缓冲生理盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶(gum?arabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等,以及其组合。必要时,可将医药制剂与助剂混合,所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香族物质和不与活性剂进行有害反应的类似物。

        引入这些组合物的方法包括(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、眼内、静脉内、皮下、局部、口服和鼻内。其它合适的引入方法也可包括可充电或生物可降解的装置、粒子加速装置(“基因枪”)和缓释聚合装置。医药组合物也可作为与其它药剂形成的组合疗法的一部分来给药。

        所述组合物可根据常规程序调配为适合于向人类或动物给药的医药组合物。举例来说,用于静脉内给药的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时,组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。各成分一般分开供应或混合于单位剂型中一起供应,例如在密闭容器(诸如指示活性剂数量的安瓿或袋)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当通过注射给药组合物时,可提供1安瓿的无菌注射用水或生理盐水以致可在给药之前混合各成分。

        因此,由于本发明,检定方法现可用于鉴别适合用于抑制肿瘤和胎儿干细胞的钟形细胞核复制的新颖治疗剂。此外,新颖治疗方法也可用于治疗与具有钟形细胞核的肿瘤干细胞相关的瘤形成前期和瘤形成。

        提供以下实施例来说明本发明且不希望以任何方式限制本发明。

        实施例:

        以下是本发明的实施例的描述。

        所有专利、公开申请案和本文中所引用的参考文献的教导都以全文引用的方式并入本文中。

        实施例1.建立组织和肿瘤的来源。

        从麻省综合医院的病理部门(Massachusetts?General?Hospital,Departmentof?Pathology)的合作者处获得作为手术丢弃物由所述合作者丢弃的成人组织和肿瘤试样(格思杰伐(Gostjeva,E.)等人,癌症遗传学与细胞遗传学(CancerGenet.Cytogenet.),164:16-24,2006)。使用匿名丢弃的肿瘤和组织切片已通过蒂利教授(Prof.W.G.Thilly)的实验室由麻省理工学院以人为实验对象委员会(MIT?Committee?on?Use?of?Humans?as?Experimental?subjects)批准。

        开发用于组织切除、固定、分散和DNA染色的方法。

        以下方案允许使具有所需透明度的组织和肿瘤试样的细胞核显像,以对染色体和细胞核进行结构和数量观察。关键要素是使用在30分钟手术内固定的新鲜肿瘤样品且避免切薄片的标准程序。钟形细胞核显然是组织和肿瘤样品中自溶作用的早期受害者且在切除术后约45分钟不再能辨别。标准5微米切片完全切开数种所发现的细胞核形式,几乎所有形式都具有大于5微米的最小直径。所设计的特定技术是显著进步的证明:

        在切除术后30分钟内,将诸如结肠粘膜条或约1mm厚的腺瘤、腺癌或转移瘤切片等薄片(约1cm2)置放于至少3体积的新鲜制备的4℃卡诺依氏固定液(Carnoy′s?fixative)(3∶1,甲醇∶冰乙酸)中。更换三次新鲜固定液(每隔45分钟)且随后用4℃70%甲醇更换以将样品贮藏于-20℃下。用蒸馏水冲洗固定的切片且在60℃下置放于2mL?1N?HCl中8分钟以使大分子部分水解和使DNA脱嘌呤。通过用冷蒸馏水冲洗来终止水解。将冲洗过的样品浸于45%乙酸中(室温)15到30分钟以进行“组织浸渍”,对显微镜盖玻片轻轻施压,从而使植物和动物组织切片分散并进行观察。将每一片浸渍过的切片等分成约0.5×1mm的两片且用5μL乙酸转移到盖玻片下方的载玻片中。为进行组织分散,将5层滤纸置放于所述盖玻片上。在一个方向上沿滤纸以微小且均匀的压力稳定地移动镊子柄。在充分分散的结肠组织中,无受损细胞核,而隐窝被压成基本上单层。在干冰上冷冻后去除盖玻片且干燥载玻片1小时。在室温下将载玻片置放于充满希夫试剂(Schiff′s?reagent)的科普林缸(Coplin?jar)中1小时以将部分脱嘌呤的DNA染色(福尔根染色),在同一科普林缸中用2×SSC(8.8g/L柠檬酸三钠、17.5g/L氯化钠)冲洗两次(一次历时30秒且一次快速冲洗)。随后用蒸馏水冲洗载玻片,且所述载玻片适合对细胞核进行影像分析(格思杰伐(Gostjeva,E.),细胞遗传学(Cytol?Genet.),32:13-16,1998)。为达到优良分辨率,进一步用吉姆萨试剂(Giemsa?reagent)将载玻片染色。用2×SSC冲洗,随后立即将载玻片置放于1%吉姆萨溶液(吉姆萨,Art.9204,默克公司(Merck))中5分钟,随后,首先用索伦森缓冲液(Sorenssen?buffer)(11.87g/L二水合磷酸氢二钠、9.07g/L磷酸二氢钾)快速冲洗,随后用蒸馏水快速冲洗。在室温下干燥载玻片1小时且置放于充满二甲苯的科普林缸中至少3小时以去除脂肪。用DePex封片剂将盖玻片与载玻片胶合且干燥3小时,随后进行高分辨率扫描。

        或者,可通过接触蛋白水解酶(例如胶原酶II)来实现浸渍,从而使活细胞与规定的细胞核形态型分离。

        显微镜和影像处理系统。

        本文中所使用的用于定量影像分析的软件利用由早期卫星监视系统修改而来的背景抑制方法。这一技术由德国(Germany)控创公司(Kontroncorporation)获得,所述公司自身先前已由蔡斯公司(Zeiss,Inc)获得。所有影像都已使用定制的3.0版KS-400影像分析系统TM(德国蔡斯公司(Zeiss,Germany))获得,所述系统由连接于个人计算机上的电动光学显微镜AxioscopeTM、彩色CCD相机AxioCamTM(德国蔡斯公司(Zeiss,Germany))组成。当仅使用富尔根染色时,使用可见光和560nm(绿光)滤光器,在平面复消色差物镜的1.4/100放大率下从显微镜透射影像。当使用福尔根-吉姆萨染色时,不使用滤光器。在每一段扫描时间之前调节帧接收器和最佳曝光。以0.0223×0.0223微米的像素尺寸记录细胞核影像。

        胚胎肠。

        在整个胎儿肠样品中发现七种独特细胞核形态型(大类球形、聚集浓缩类球形、卵形、豆形、雪茄状、香肠状和钟形)(图1A)。钟形细胞核似乎由类似聚集浓缩染色体的聚集浓缩染色质保持打开。钟形细胞核在约20-50微米管中以线性‘头脚’定向组织化,或为合胞体(图2)。在所观察的所有胚管中都保持钟形细胞核的‘头脚’模式,但管来回蛇形延伸,使得平行管具有局部反平行钟形细胞核定向。

        观察到钟形细胞核经历对称和不对称无丝分裂,但仅在合胞体中出现(图3)。钟形细胞核的对称无丝分裂类似两个堆叠纸杯的简单分离。在最高分辨率下,类似配对染色体的聚集浓缩染色质似乎形成圆环,所述圆环使钟形物的“开口”保持打开状态。数种“闭合”的细胞核形态型中的每一者都经常在管状合胞体有丝分裂外观察到,且小群落显然由相同细胞核形态型的细胞组成。如图1中所示,在早前期保持特定的“闭合”细胞核形态。

        正常结肠上皮。

        从隐窝底部到内腔表面可观察到隐窝中的几乎所有细胞核(图4A)。许多隐窝以使得可辨别个别细胞核形状的方式分散。具有卵形或类球形细胞核的细胞顺着隐窝从恰好底部上方到延伸到内腔中的上皮排列(图4C)。在隐窝底部的前面约25个细胞中,潜在独特的第九种细胞核形态型占优势,其可表征为约2-3微米厚且直径为约10微米的盘状(图4B)。在细胞充分分离的所有隐窝底部的不足1%中,在明显盘状细胞核中辨别出单个钟形细胞核(图4A和4B)。已在成人肝的制备物中观察到钟形细胞核的类似的低出现率。在没有瘤形成或瘤形成前期的任何病理病症的成人结肠中,在对超过一千个充分分散的隐窝的逐个细胞扫描中未观察到其它细胞核形态学变异体。

        腺瘤。

        腺瘤含有许多隐窝,无法与各具有约2000个细胞的正常结肠隐窝区分。如图5A中所示,发现这些隐窝经常呈分枝形式。隐窝壁中存在与正常结肠隐窝相同、但比正常结肠中更频繁出现的类球形和卵形细胞核,在隐窝底部存在一个或两个钟形细胞核。也观察到不规则小叶结构含有多达约8000个细胞,所述细胞更容易通过组织浸渍来分散。在几乎所有的不规则结构中都存在两个或两个以上钟形细胞核,所述钟形细胞核由钟形物开口在结构主体方向上定向(图5B)。另外,许多不同细胞和细胞群散置在隐窝和不规则结构中(图5C)。一些规则结构似乎向着含有约250、约500或约1000个细胞的全尺寸正常隐窝生长??吹叫矶嘞赴何哂姓?、16、32、64和128个细胞的“环”形式,所述环各具有一个钟形细胞核(图5D)。

        较高放大率检查结果显示,隐窝样结构的壁的大部分细胞具有如正常成人结肠隐窝中一样的球形或卵形细胞核。具有卵形、雪茄状或子弹状细胞核的细胞群落出现在不规则小叶结构中,表明这是数个不同群落的融合体。已在胚胎后肠中观察到具有卵形和雪茄状细胞核的群落,但仅在腺瘤和腺癌中看到子弹状细胞核形态型(图5E)。子弹状细胞核形态型也通过首先形成不规则末端的不对称无丝分裂而由钟形细胞核产生??吹骄哂凶拥聪赴说男∠赴郝淝艺庑┤郝浜芯胀ㄓ兴糠至训南赴?,但存在以下所关注的事实:从前期到后期在某种程度上保留特殊细胞核形态。

        虽然在正常成人结肠中罕见,但钟形细胞核经常出现于多种腺瘤境况内。一些细胞核是以1到10个或更多个“钟形物”形式存在于隐窝样结构间的间隙中(图5D)。其它细胞核是以单一“钟形物”形式存在于多细胞环结构中,其中始终看到一个钟形细胞核位于具有(2n-1)个类球形或其它形态型的细胞的环中(图5C和5D)。

        钟形细胞核以单一钟形物形式,更通常以一对钟形物或偶尔4或8个钟形物形式出现在隐窝样结构底部的杯状物中。在大得多的不规则小叶结构中,从解剖学上看,钟形细胞核整合到与其它细胞核形态的细胞混合的异常结构的壁中??蠢凑庑┙洗蟮牟还嬖蛞蜒峁故嵌嘀植煌旱那逗咸?,所述群各自具有自己的细胞核形态型。据估计,大腺瘤(约1cm)含有约1000个钟形细胞核。已在多种腺瘤中各观察到数百个钟形细胞核,但未观察到任何腺瘤中的单个钟形细胞核以在胚胎切片中经??杉亩猿菩问浇邢赴朔至?;然而,已在腺瘤中观察到不对称细胞核分裂的数个实例。

        腺癌。

        腺癌与腺瘤类似,含有隐窝、较大不规则结构和具有16、32、64和128个细胞的隐窝间群的混合形式。钟形细胞核仍以单态、成对或较大数目存在于隐窝的底部杯状物中且包埋于较大不规则小叶结构的壁中的复杂螺层中(图6)。腺癌中的细胞核形态型组似乎与腺瘤中所见的组(包括子弹状形态型)一致。

        腺瘤与腺癌之间可辨别的差异在于,隐窝样结构相对于肿瘤表面随机定向。在肿瘤内部也并未频繁发现隐窝和不规则结构,这可较好地表征为较小的局部组织化结构的选择集合而非无秩序集合。

        腺癌不同于腺瘤的最显著差异在于经常出现超过数百个钟形细胞核的明显组织化组,这些钟形细胞核中的一些经常(约1%)与对称细胞核分裂有关。这些对称分裂稍后被鉴别为包含聚集浓缩的细胞核物质。钟形细胞核所具有的DNA的量等于正常单倍体细胞的DNA的量。当钟形细胞核开始经历“杯与杯(cup-from-cup)”对称分裂时,DNA含量增加到单倍体基因组中DNA含量的1.05倍(如果复制着丝粒,那么预期大概增加1倍)。DNA含量保持这一水平直到“杯与杯”过程的较晚些时候,这时两个细胞核含有2倍的DNA物质的量。这是在或许仅复制着丝粒的阶段期间,且基因组的各链分离,基因组主要组织化成ssDNA。直到在所述过程的较晚些时候进行复制时,基因组才再次变成dsDNA。

        在低放大率下,这些结构出现在隐窝样结构间的间隙中且看上去像蜘蛛网或叶脉骨架。在较高放大率下,发现细脉络部分地按具有钟形细胞核的细胞链排列,所述细胞链具有其开口在与脉络轴成90°的相同方向上定向的奇怪特征(图6C)。也在局部界定的合胞体中发现钟形细胞核呈在胚胎肠而非腺瘤中观察到的‘头脚’定向(图6C)。据估计,数百万个钟形细胞核在腺癌肿块中以常见的对称和不对称形式进行无丝分裂(图6D和6E)。结肠直肠肿瘤转移到肝可重新形成看似无法与关于腺癌所观察相区分的细胞核形态型、隐窝和不规则结构模式。

        对以3D形式保存的单个钟形细胞核和成对对称分裂的钟形细胞核执行共焦显微术。

        为对以3D形式保存的单个钟形细胞核和成对对称分裂的钟形细胞核执行共焦显微术,使用怀特海研究所影像中心(Imaging?Center,Whitehead?Institute)的DeltaVisionRT复原成像系统。所述系统提供实时2D去卷积和3D?Z投影来复原细胞核影像。

        应用细胞核细胞质(FITC-毒伞素(phalloidin))和细胞核(DAPI)的复染色来研究钟形细胞核的内部结构。按照与福尔根染色相同的程序,将细胞分散到载玻片上:‘水解’浸渍。不同之处在于应用两种不同固定液进行固定以比较结果:在100mL?PBS(室温)中的2%BSA(2g)、0.2%脱脂乳(0.2g)、0.4%triton?X-100(400μL)中使用卡诺依氏固定液(4℃)和3.7%甲醛15分钟和使用阻断溶液2小时,推荐后者用于固定活组织细胞。将上面有组织分散物的显微镜载玻片用PBS洗涤两次,接着转移到潮湿箱中,滴100mL用阻断溶液适当稀释的初级抗体液滴以覆盖整个分散物区域且用橡胶胶水将盖玻片密封在上面,置放于以箔包裹的容器中并置放于冷却室中的潮湿箱中过夜。随后用PBS洗涤未密封的载玻片三次。取出所述载玻片且再次放置100μL用阻断溶液适当稀释的二级抗体液滴和/或细胞染色剂(例如FITC-毒伞素、DAPI)以覆盖含有细胞分散物的区域,并转移到潮湿箱中,置放于容器中。所述容器/潮湿箱是密封的,以箔包裹且置放于室温下2小时。用PBS洗涤载玻片五次且以各具有2-5μL封片剂液滴(抗荧光衰减封片剂(anti-fade)SlowFade、VectaSheild或Prolong)的方式制备。安放盖玻片,确保去除过量PBS(在纸巾上轻擦盖玻片的角)。将盖玻片的边缘引入封片剂中,随后使安放期间形成的气泡数目完全降低,从而限制所述气泡数目。使用指甲油将盖玻片密封在载玻片上且在4℃下避光贮藏载玻片(或在-20℃下较长时间)。使用Delta?VisionRT复原成像系统使载玻片显像。

        使用已证实可精确进行DNA的细胞化学定位和化学计量的福尔根-希夫程序(Feulgen-Schiff?procedure)的方案来测量细胞核DNA含量。通过测量福尔根-DNA(染料-配体)复合物的分子吸光度来测量单一细胞核中的DNA含量(谢尔斯特兰德(Kjellstrand,P.),显微术杂志(J.Microscopy),119:391-396,1980;安德森(Andersson,G.)和谢尔斯特兰德(Kjellstrand,P.),组织化学(Histochemie),27:165-200,1971)。使用由KS?400影像分析系统(德国蔡斯公司(Zeiss?Inc.Germany))修改而来的软件来测量各个细胞核的整个区域上的积分光学密度(IOD),从而测量不分裂(间期)和分裂的钟形细胞核。

        这一特定影像分析工作站(参见图9D)由连接于计算机上的显微镜Axioscop?2MOT(蔡斯公司(Zeiss))联合AxioCam彩色CCD相机(蔡斯公司(Zeiss))组成,其由卡尔蔡斯公司(Carl?Zeiss?Inc.)工程师组装,能够对细胞核和细胞结构进行高分辨率影像显微术,在早前期染色体测量中是每个像素约1000bp?DNA。因此,有可能精确测量间期细胞核中约1Mb对的聚集浓缩染色质域。在细胞核的恒定放大率、曝光和阈值处理(边缘增强)参数下,使用560nm绿色滤光器扫描影像。选择这种DNA含量测量方式,因为有希望得到最精确的结果(贝斯德(Biesterfeld.S.)等人,分析和定量细胞学与组织学(Anal.Quant?Cytol.HistoL),23:123-128,2001;哈迪(Hardie,D.)等人,组织化学与细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.),50:735-749,2002;格雷戈里(Gregory)和赫伯特(Hebert),2002;格雷戈里(Gregory),2005)。

        进行荧光原位杂交以界定处于间期和细胞核分裂期间的钟形细胞核中所有24条人类染色体的空间分布。

        使用FISH确定在钟形细胞核顶部以‘环’形式表现的聚集浓缩所涉及的全部染色体?;旧?,预见对‘环’中的染色体加标记以及开发通过除细胞核形态外的其它方法识别这些细胞核的荧光标记作为当钟形细胞核产生不同形态的细胞核(如图10B中所示)时分析其转化的方法。

        将每个载玻片不超过1-5×107个细胞的肿瘤细胞分散到载玻片上。以两种不同的细胞分散方式固定载玻片:一种方式用于福尔根DNA影像细胞计量术的方案中且另一种方式由吉普森(Gibson)提出用于从结肠镜检查的活检试样中分离上皮细胞(吉普森(Gibson,P.)等人,胃肠病学(Gastroenterology),96:283-291,1989)。后一种方式基本上使用30分钟手术内的肿瘤组织且立即将其置放于50mL冷汉氏平衡盐溶液(Hank′s?balanced?salt?solution)中,随后洗涤。随后用解剖刀片切碎试样且在4mL胶原酶-分散酶培养基(含有1.2U/m1分散酶I(印第安纳州印第安纳波利斯的柏林格尔曼海姆生物化学公司(Boehringer?Mannheim?Biochemicals,Indianapolis,Ind.))和50U/ml?IV型胶原酶(纽约州费里霍尔德的沃辛顿生物化学公司(Worthington,Biochemical?Corp.,Freehold,N.J.))的培养基)中消化1.5小时。对盖玻片轻轻施加滑压,从而将小球分散到显微镜载玻片的表面上。通过‘水解’浸渍进行分散充当阳性对照组以检测在应用胶原酶-分散酶处理以使细胞分散后是否发生钟形细胞核形态的任何变形。使所准备的载玻片干透且置于37℃下过夜。随后依次用冰冷70%、80%、室温100%乙醇使载玻片脱水,每次历时2分钟,且完全干燥的载玻片在72℃下在70%甲酰胺/2×SSC中经历变性历时2分钟,立即用相同顺序再次脱水并完全干燥。制备含有7μL杂交缓冲液、2μL无菌水和1μL探针的杂交混合物。使混合物在72℃下变性8到12分钟且立即添加到载玻片中,随后盖上盖玻片,用橡胶胶水密封,且置于37℃的避光加湿箱中过夜。

        随后用冷70%乙醇、冷80%乙醇和室温100%乙醇使载玻片脱水,每次历时2分钟;在72℃下用70%甲酰胺、2×SSC变性50-60秒,这取决于乙酸变性的程度。再次用冷70%乙醇、冷80%乙醇和室温100%乙醇使载玻片脱水,每次历时2分钟。杂交混合物包括7μL杂交缓冲液、1.5μL无菌H2O和1.5μL。应用全染色体上色探针(威赛斯公司(Vysis))和光谱橙色或光谱绿色荧光染料。在72℃下使杂交混合物变性5-10分钟且随后完全干燥载玻片。将杂交混合物涂覆于载玻片上,盖上盖玻片且用橡胶胶水密封。随后在37℃的加湿箱中培育载玻片过夜。第二天,在42℃下用50%甲酰胺、2×SSC洗涤载玻片,每次8分钟。随后在37℃下用2×SSC洗涤载玻片8分钟且随后在室温下用1×PBD(0.05%吐温(Tween)、4×SSC)洗涤三次,每次1分钟。随后添加10μL?DAPI?II抗荧光衰减封片剂(125ng/mL,威赛斯公司(Vysis))和盖玻片。吸除过量的DAPI?II抗荧光衰减封片剂,且用橡胶胶水密封载玻片。在-20℃下使载玻片保持避光,随后进行影像扫描程序。

        在钟形细胞核的细胞核分裂之前、期间和之后使用定量DNA细胞计量术来追踪DNA合成。

        本文所述的技术允许检测人类细胞培养物中在有丝分裂期间任何两种细胞核或后期成对细胞核之间低达2%的差异。使用这些技术来确定何时通过含有钟形细胞核的细胞或合胞体合成DNA。这涉及扫描似乎处于细胞核分裂过程中的细胞核。应注意,一般来说,与同一染色载玻片上的人类淋巴细胞DNA含量相比,胎儿钟形细胞核含有预期量的二倍体人类细胞的DNA。另外,应注意,人类瘤形成前病变和肿瘤的钟形细胞核中DNA的量显示围绕平均大于二倍体DNA量的平均值的广泛变化。测量已揭露另一个完全出乎意料的发现:对于涉及钟形细胞核的对称和不对称细胞核分裂,DNA合成与细胞核分裂过程一致,而非在细胞核分裂过程之前。细胞核似乎完全按照‘杯与杯’分离过程,随后明显地检测到总DNA含量从单个细胞核的量开始增加。DNA总量从接近明显开始分裂的细胞核中的单一肿瘤细胞核平均值的低值开始增加且达到似乎即将完成分裂的细胞核中的平均细胞核含量的约两倍。

        实施例2.胎儿器官发生中的合胞体钟形细胞核。

        在产生钟形细胞核的人类胎儿制备物中鉴别出一系列先前未识别的细胞核形式。在第五周检测到这些形式,也检测到含有钟形细胞核的第一管状合胞体。这些细胞的实例展示于图13A-13D中。这是重大发现,指出从早期胚胎发生的有丝分裂球形细胞核到稍后表示净生长和分化的生殖“干”细胞谱系的无丝分裂钟形细胞核的形态学转变。

        这些发现在组织类型间是一致的,因为已在一系列组织制备物中观察到这些发现,包括例如肌肉、发育中的肢体、神经组织和包括胃、胰腺、膀胱、肺和肝的脏器。合胞体以有规律间隔的约16-24个合胞体的群形式存在于发育中的器官团块中,其中每个群具有约16个钟形细胞核。合胞体在发育最少的可利用人类物质(约5周)中很明显且在第十三周时消失。第十二周后,钟形细胞核以每种器官所特有的方式有规律地分布于三维空间中。

        图13A展示呈围绕球形或略微卵形细胞核的长轴的“带”形式的具有聚集浓缩约10%的总DNA含量的细胞核。图13B展示2个聚集浓缩的细胞核“带”似乎已分离、但仍然是单个细胞核的一部分的细胞核。图13C展示似乎通过图13B的双带状细胞核的分裂所产生的一对细胞核。图13D展示每一个合胞体都含有一组钟形物,其中如图13C中,单一一对钟形物在其直线中点处以开口相对。这些影像向我们表明,一系列对称分裂形成从中心对推开的细胞核。在少到4个钟形细胞核的组中检测到合胞体结构。

        在癌发生的细胞核形态型的研究中,在结肠腺瘤(图14A)和腺癌(图14B)中,细胞核显示少量类似的带,即一个或两个围绕卵形细胞核的长轴的带。这一发现证实并扩充了对以下一般假说的支持:肿瘤发生共用个体发生的许多关键的表型过渡步骤,然而以相反的出现顺序呈现。

        对人类着丝粒具有特异性的FISH染色。

        合胞体外钟形细胞核实际上含有人类DNA。在胎儿样品中,大部分着丝粒与钟形细胞核的开口处的聚集浓缩DNA区域相关。有趣的是,标准FISH方案不使合胞体内钟形或其它形状细胞核染色,这表明合胞体的含有收缩元素的外鞘可阻断FISH试剂的进入。图15展示来自人类12周胎儿结肠组织的球形(图15A)、“雪茄”状(图15B)和钟形(图15C)细胞核内的着丝粒(绿色)。

        也观察到,在钟形细胞核的胎儿无丝分裂中成对细胞核的DNA含量相等,但在来自多个组织来源的人类肿瘤中的钟形细胞核的无丝分裂中其显示显著程度的不等DNA分离。尽管尚未发现结肠瘤形成前息肉的钟形细胞核中无丝分裂的实例,但应注意,每个息肉所发现的许多钟形细胞核中DNA含量的显著分散表明,不等DNA分配是在瘤形成前期以及瘤形成中,而不是在钟形细胞核的胎儿分裂中起作用的现象。这些观察结果扩充了菲尔绍(Virchow)和康海姆(Cohnheim)的观察结果:肿瘤组织和胚胎组织具有类似的组织学特征,同时也扩充了勃法瑞(Boveri)的观察结果:处于有丝分裂中的肿瘤细胞显示肿瘤的所有细胞所共有的大部分畸变染色体,表明不稳定染色体形成或分离的早期共同来源。

        小鼠的细胞核形态。

        在胎儿小鼠的组织中发现形态与图13A-13D几乎相同的所有各种形式的细胞核(具体来说,包括钟形细胞核、前合胞体和合胞体形式),其中首先在密切平行于胎儿小鼠的器官界定时段的12.5日胎儿、随后在14.5-16.5日胎儿中检测到前合胞体形式。虽然假设是人类观察结果,小鼠中的这些发现并不令人惊讶,但其显示在非人类物种中进行在人类中不道德或不可能的的器官发生研究的各种可能性。

        在介于妊娠第五周到第十六周范围内的品质固定的胎儿丢弃物的样品中,合胞体不再明显,但钟形细胞核以规则模式分布于生长器官中。

        实施例3.干细胞标记

        使用原肠的丰富的合胞体和钟形细胞核来应用一系列组织化学程序(包括FISH),从而界定染色体和染色体元素、各种收缩分子(例如肌动蛋白)和其它可鉴别标记(包括常称为“干细胞标记”的标记)的位置。将本文所述的技术应用于使用ZEISS-P.A.L.M.显微解剖仪器收集合胞体和个别细胞核的工作。成功标准是收集一系列就合胞体形式或细胞核形态型来说均质的样品,其数目等于或大于10,000个细胞核同等物,数目足以扫描细胞mRNA、最常见蛋白质和葡糖胺聚糖。

        实施例4.吖啶橙染色

        其它鉴别复制中间物构型的资料展示于图16-19中。图18B尤为重要。其最后证实ssDNA基因组存在于钟形细胞核中。利用吖啶橙染色,其特定地且仅在结合ssDNA后发红色荧光。

        在染色之前,在37℃的水浴中使载玻片接触浓度为2mg/mL的RNA酶历时2小时。用EDTA洗涤载玻片1分钟,用分子级水冲洗且立即根据贝塔朗菲(Bertalanffy)(纽约科学年鉴(Ann?New?York?Sci),84:第227-238页(1960);纽约科学年鉴(Ann?New?York?Sci)93:16:第717-747页(1962))中所述的方案,用吖啶橙溶液进行染色。简单来说,吖啶橙染色剂是用500.0ml蒸馏水稀释的0.05gm且添加5.0ml乙酸。每次在避光、室温下将载玻片置放于科普林缸中之前,检查室温溶液的pH值,使其在3.1-3.4范围内。将载玻片染色30分钟,用0.5%乙酸的100%乙醇溶液、100%乙醇、PBS冲洗且在仍然湿润时盖上盖玻片,在荧光显微镜下显像。

        实施例5.ssDNA抗体染色

        使用单克隆抗体Mab?F7-26来检测ssDNA中间物(奥地利维也纳的本德米思特斯有限公司(Bender?MedSystems?GmbH,Vienna,Austria))。在使用之前将抗体的储备溶液稀释10倍(用PBS和5%胎牛血清)。在施加ssDNA抗体之前,使用10mM?HCl、50mM?MgCl2中的0.005%胃蛋白酶和50mM?MgCl2中的1%甲醛(详细描述于佛米娜(Fomina)等人,2000中)执行一系列洗涤步骤。每一洗涤步骤后,用PBS洗涤载玻片3次(每次5分钟)。最后,用0.05%吐温洗涤载玻片,随后用阻断蛋白质3%BSA的吐温溶液和再次用0.05%吐温洗涤。之后,在室温下用Mab?F7-26的5%FBS溶液处理载玻片60分钟,随后施加抗小鼠Ig-G-FITC(Alexa?488)30分钟。用DAPI将载玻片染色,用一系列70%、90%和100%乙醇脱水,风干且安放于‘Citiflour’培养基中。

        看来钟形细胞核的“开口”处的双dsDNA环首先分离成2个ssDNA环且这些环进行拷贝,形成4个dsDNA环,先前使用福尔根染色和定量细胞计量术作为钟形物分离和DNA增加的开始进行观察。

        值得注意的是,在任何组织样品的胎儿巨核细胞合胞体阶段,仅约5-15%的合胞体显示ssDNA,但在那些显示ssDNA的具有至少一个细胞核的合胞体中,通常观察到许多其它情况,这扩充了我们的早期观察结果:合胞体中的钟形细胞核同步分离且合成DNA?;谔ザ纳に俾屎拖允救魏蝧sDNA的细胞核的分率,我们已作出约8小时的初步估计,这是DNA分离/合成时段的4倍,其中分离ssDNA团块的时间略少于这一时段的一半。参见图18A-18F。

        虽然本发明已特定地参考其优选实施例来展示和描述,但所属领域的技术人员应了解,可在不脱离由随附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下对形式和细节作出各种变化。

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    用于 通过 靶向 肿瘤 干细胞 SSDNA 复制 中间 抑制 生长 方法 药剂
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