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    关 键 词:
    区分 结肠 直肠 腺瘤 腺癌 方法 工具
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    摘要
    申请专利号:

    CN200880011036.2

    申请日:

    2008.04.03

    公开号:

    CN101711362A

    公开日:

    2010.05.19

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20100519|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/574申请日:20080403|||公开
    IPC分类号: G01N33/574 主分类号: G01N33/574
    申请人: 基督教高等教育科学研究及病人护理协会
    发明人: G·A·梅杰; B·平托莫雷斯德卡瓦尔霍
    地址: 荷兰阿姆斯特丹
    优先权: 2007.04.05 EP 07105722.8
    专利代理机构: 中国专利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 李波;刘红
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200880011036.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.03.23|||2010.07.07|||2010.05.19

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞中基因的差异标记以及它们与染色体异常的关联。本发明提供了用于检测与腺瘤进展为腺癌细胞相关的染色体异常的工具。本发明公开了用于体内和体外诊断结肠直肠肿瘤的方法和工具。

    权利要求书

    1: 用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤: a)在所述患者的受试样品中检测至少表8、9或16的标记基因NM_017495和NM_006602的表达水平,和 b)比较用于步骤a)中的所述标记基因的表达水平与对照样品的表达水平, 其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少两种标记基因表达水平的升高,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。
    2: 权利要求1的体外方法,包括以下步骤: a)在所述患者的受试样品中检测至少表8、9或16的标记基因NM_017495、NM_006602、NM_018840、NM_003600、NM_018270、NM_007002和NM_016397的表达水平,和 b)比较用于步骤a)中的所述标记基因的表达水平与对照样品的表达水平, 其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少7种标记基因表达水平的升高,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。
    3: 用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤: a)在所述患者的受试样品中检测选自表1所列标记基因的至少12种标记基因的表达水平,和 b)比较用于步骤a)中的标记基因的表达水平与对照样品的表达水平, 其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少12种标记基因表达水平的升高或降低,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。
    4: 用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤: a)在所述患者的受试样品中检测选自表17所列标记基因的一种或多种标记基因的表达水平,和 b)比较用于步骤(a)中的所述至少一种标记基因的表达水平与对照的表达水平, 其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述一种或多种标记基因表达水平的升高或降低,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。
    5: 用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤: a)在所述患者的受试样品中检测一种或多种标记基因的表达水平,所述标记基因的表达在存在染色体异常时改变,其中所述一种或多种标记基因包括: -选自表2中描述的标记基因的两种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体8p上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表3中描述的标记基因的一种或多种标记基因,其表达水平由于染色体8q上的染色体获得而改变,和/或, -选自表4中描述的标记基因的3种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体13q上的染色体获得而改变,和/或, -选自表5中描述的标记基因的一种或多种标记基因,其表达水平由于染色体15q上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表6中描述的标记基因的一种或多种标记基因,其表达水平由于染色体17p上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表7中描述的标记基因的3种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体18q上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表8中描述的标记基因的9种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变,和/或, -选自表9中描述的标记基因的两种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变;和 b)比较用于步骤(a)中的所述一种或多种标记基因的表达水平与对照样品的表达水平, 其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述一种或多种标记基因表达水平的升高或降低,表明所述患者中腺癌细胞的存在。
    6: 用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤: a)在所述患者的受试样品中检测多种标记基因的表达水平,所述标记基因的表达在存在染色体异常时改变,所述多种标记基因包括: -选自表2中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体8p上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表3中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体8q上的染色体获得而改变,和/或, -选自表4中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体13上的染色体获得而改变,和/或, -选自表5中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体15q上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表6中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体17p上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表7中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体18q上的染色体缺失而改变,和/或, -选自表8或表9中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变,和 b)比较用于步骤a)中的标记基因的表达水平与对照样品的表达水平, 其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述多种标记基因表达水平的升高或降低,表明所述患者中腺癌细胞的存在。
    7: 权利要求3-6的任一项的方法,其中根据表1-9,所述标记基因具有小于0.05的p或FDR值。
    8: 权利要求3-6的任一项的方法,其中根据表1-9,所述标记基因具有小于0.01的p或FDR值。
    9: 权利要求3-8的任一项的方法,其中根据表2-9,所述标记基因在腺瘤和腺癌细胞之间的表达水平的差异是至少“2”。
    10: 权利要求3-8的任一项的方法,其中根据表2-9,所述标记基因在腺瘤和腺癌细胞之间的表达水平的差异是至少“4”。
    11: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体8p上的染色体缺失而改变的标记基因选自下组标记基因:表10中描述的NM_020749、NM_004315、NM_003747、NM_016353、NM_152415、NM_006197、NM_000662、NM_000015、D31887、NM_017884、NM_004462、NM_006765、 NM_001715、NM_012331、NM_139167、NM_013354和NM_005144。
    12: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体8q上的染色体获得而改变的标记基因选自下组标记基因:表11中描述的NM_138455、NM_032611、NM_032862、AL713790、BC030520、NM_024035、NM_017767、NM_002346、AF289596、NM_012162和AB051475。
    13: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体13q上的染色体获得而改变的标记基因选自下组标记基因:表12中描述的NM_145293、NM_005358、U50531、NM_012158、NM_017817、NM_003899、NM_003903、NM_018386、BC008975、NM_023011、NM_001260、NM_006646、U50524、NM_033111、NM_024808、NM_014832、NM_006002、NM_015057、NM_024546、BC026126、NM_006493、NM_018210和NM_017664。
    14: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体15q上的染色体缺失而改变的标记基因选自下组标记基因:表13中描述的NM_030574、NM_004255、NM_002573、AB033025、NM_033240、NM_000126、NM_015079、NM_015969和NM_016073。
    15: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体17p上的染色体缺失而改变的标记基因选自下组标记基因:表14中描述的NM_130766、NM_015721和NM_031430。
    16: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体18q上的染色体缺失而改变的标记基因选自下组标记基因:表15中描述的NM_004715、NM_006701和NM_014913。
    17: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变的标记基因选自下组标记基因:表16中描述的NM_016397、NM_018270、NM_006602、NM_080476、NM_017896、NM_006097、NM_021809、NM_018840、NM_003600、NM_017495、NM_007002、NM_016354、NM_014071、NM_002212、NM_003185、NM_152255、NM_022082、NM_018244、NM_014902、NM_032013、NM_020182、NM_006886、NM_020673、BC003122、NM_012325、NM_014183、NM_021100、NM_004738、NM_016045、NM_014054、NM_022105、NM_015666、NM_032527、BC025345、NM_033405、NM_006892、NM_005225、NM_000687、BC035639、NM_018677、NM_006047、NM_016436、NM_015511、NM_016082、NM_007238、NM_003908、NM_003610、NM_153360、NM_080425、NM_000114、NM_001853、NM_144498、NM_017798和NM_012384。
    18: 权利要求5或6的方法,其中表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变的标记基因选自下组标记基因:表16中描述的NM_016397、NM_018270、NM_006602、NM_080476、NM_017896、NM_006097、NM_021809、NM_018840、NM_003600、NM_017495、NM_007002、NM_016354、NM_014071、NM_002212、NM_003185、NM_152255、NM_022082、NM_018244、NM_014902、NM_032013、NM_020182、NM_006886、NM_020673、BC003122、NM_012325、NM_014183、NM_021100、NM_004738、NM_016045、NM_014054、NM_022105、NM_015666、NM_032527、BC025345和NM_033405。
    19: 权利要求1-18的任一项的方法,其中所述受试样品是结肠直肠腺瘤组织的活检物或切除物。
    20: 权利要求1-18的任一项的方法,其中所述受试样品选自尿、血液、唾液、汗液和粪便的样品。
    21: 权利要求1-19的任一项的方法,其中所述对照样品是包含结肠直肠腺瘤细胞而不包含结肠直肠癌细胞的患者的相同组织的样品。
    22: 权利要求1-21的任一项的方法,其中所述表达水平是在蛋白水平确定的。
    23: 权利要求1-21的任一项的方法,其中所述表达水平是在RNA水平确定的。
    24: 权利要求1-23的任一项的方法,其中使用的标记基因是这样的标记基因:与腺瘤细胞相比,其表达水平在腺癌细胞中升高。
    25: 权利要求1-24的任一项的方法在诊断结肠直肠腺瘤进展为结肠直肠癌中的用途。
    26: 用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,包含用于特异性检测表1中描述的至少12种标记基因的表达的试剂。
    27: 用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,包含用于特异性检测表17中描述的至少一种标记基因的表达的试剂。
    28: 用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,包含用于特异性检测一种或多种标记基因的表达的试剂,所述试剂盒包含: -用于特异性检测选自表2中描述的标记基因的3种或更多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表3中描述的标记基因的一种或多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表4中描述的标记基因的两种或更多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表5中描述的标记基因的一种或多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表6中描述的标记基因的一种或多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表7中描述的标记基因的3种或更多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表8中描述的标记基因的7种或更多种标记基因的试剂,和/或, -用于特异性检测选自表9中描述的标记基因的7种或更多种标记基因的试剂。
    29: 用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,包含用于特异性检测下组中每一组中至少一种标记基因的表达的试剂集合:表2中描述的标记基因、表3中描述的标记基因、表4中描述的标记基因、表5中描述的标记基因、表6中描述的标记基因、表7中描述的标记基因、表8中描述的标记基因和表9中描述的标记基因。
    30: 权利要求26-229的任一项的试剂盒,其中根据表1-9,所述标记基因具有小于0.05的p或FDR值。
    31: 权利要求26-29的任一项的试剂盒,其中根据表1-9,所述标记基因具有小于0.01的p或FDR值。
    32: 权利要求27-31的任一项的试剂盒,其中根据表2-9或17,所述标记基因在腺瘤和腺癌细胞之间的表达水平的差异是至少“2”。
    33: 权利要求27-31的任一项的试剂盒,其中根据表2-9或17,所述标记基因在腺瘤和腺癌细胞之间的表达水平的差异是至少“4”。
    34: 权利要求26-33的任一项的试剂盒,其中所述试剂是寡核苷酸或抗体。
    35: 权利要求34的试剂盒,其中所述寡核苷酸排列在支持物上。
    36: 权利要求34的试剂盒,其中所述抗体结合于分泌的蛋白或细胞表面上的蛋白。
    37: 权利要求26-36的任一项的试剂盒,其中所述一种或多种试剂用选自放射性标记 物、磁性标记物、MRI造影标记物、发色标记物和超声标记物的标记物官能化。
    38: 权利要求26-36的任一项的试剂盒,其中所述标记基因是这样的基因:与腺瘤细胞相比,其表达水平在腺癌细胞中升高。
    39: 用于检测结肠直肠病变中的腺癌细胞的体内方法,所述方法包括以下步骤: a)使所述结肠直肠病变与经标记的试剂接触,所述试剂能够与选自表17中描述的基因的标记基因表达的蛋白特异性结合或相互作用,和 b)检测该试剂与所述结肠直肠病变的结合或相互作用, 其中检测到所述结肠直肠病变的病灶内所述试剂的结合或相互作用的差异,表明所述病变中腺癌细胞的存在。
    40: 权利要求39的方法,其中所述标记基因是位于细胞膜上的蛋白、分泌的蛋白或酶。
    41: 与表17或18中描述的标记基因特异性结合或相互作用的试剂,其用作检测结肠直肠腺瘤组织中腺癌细胞的存在的体内诊断剂。
    42: 与表17或18中描述的标记基因特异性结合或相互作用的试剂在制备诊断剂中的用途,所述诊断剂用于检测结肠直肠肿瘤组织中腺癌细胞的存在。

    说明书


    区分结肠直肠腺瘤和腺癌的方法和工具

        【发明领域】

        本发明涉及用于肿瘤诊断,更具体是用于诊断结肠直肠腺瘤和腺癌的方法。本发明进一步提供了用于进行这些方法的标记基因、探针和阵列。

        【发明背景】

        胃肠道的结肠直肠部分的癌症是一种常见病症。在第一阶段,发生良性肿瘤(腺瘤),其可以转变为恶性癌症(腺癌)。不是所有的腺瘤都进展为腺癌。实际上,这种向腺癌的进展仅仅发生在小的肿瘤亚群中?;蜃椴晃榷ㄐ缘钠鹗际枪丶街?,并且在结肠直肠癌中以两种方式发生(Lengauer?et?al.(1998)Nature,396,643-649)。已经最广泛研究了导致微卫星不稳定性(缩写为MIS或MIN)的DNA错配修复缺陷(di?Pietro?et?al.(2005)Gastroenterology,129,1047-1059),但仅仅解释了约15%的腺瘤进展为腺癌。在结肠直肠腺瘤进展为腺癌的其他85%的情况下,基因组不稳定在染色体水平(CIN)发生,产生非整倍性。尽管在长时间中,这些染色体异常被认为是继发于癌症发展的随机噪音,已经充分确立了这些DNA拷贝数改变以特定模式发生,并且与不同的临床行为相关(Hermsen?et?al.(2002).Gastroenterology?123,1109-1119)。在结肠直肠癌中经常报道的染色体异常是7pq,8q,13q,20q获得和4pq,5q,8p,15q,17p,18q缺失。已经显示了8q,13q和20q获得以及8p,15q,17p和18q缺失与结肠直肠腺瘤进展为腺癌相关(Hermsen?et?al.(2002)cited?above)。染色体臂20q的获得是在结肠直肠癌中观察到的最常见的获得,在65%以上的情况下改变(Meijer?etal.(1998)J.Clin.Pathol.51,901-909)。20q上的获得,特别是20q12-q13区上的获得,也通常在其他类型的实体瘤中描述,并且与胃和结肠直肠癌的不良结局相关。

        临床上最重要的是尽量早期鉴定上述腺瘤向腺癌的进展,使得能够早期治疗癌,同时避免对腺瘤的不必要的手术干预。理想地,腺癌可以在恶性的细胞存在通过经典显微镜分析还不能检测的阶段时就被鉴定出来。

        不同的研究参照了单个或有限组的基因,与腺癌相比,它们在腺瘤中显示不同的表达水平,大多数情况下与作为基础的染色体不稳定性不相关(Habermann?et?al.(2007)Genes?Chromosomes?Cancer.46,10-26,US20040258761)。

        发明概述

        本发明基于以下观察结果,即,当与结肠直肠腺瘤细胞的基因表达模式相比时,在结肠直肠腺癌细胞中的基因表达模式中存在显著差异,并且这些差异与腺癌中的染色体异常的存在相关。因此,可以根据染色体异常对腺癌分类,并且已经鉴定了这些染色体异常的标记基因。在本分析中调查的大量样品得到了用于所有存在的染色体异常的一个标记基因集合。

        因此,本发明涉及用于癌症诊断的方法和工具,更特别是用于区分结肠和/或直肠中的腺瘤和癌的方法和工具。更具体地,本发明涉及检测腺瘤向腺癌的进展。本发明的方法的优点是它们允许在非常早的阶段,即在能够通过回波描记术、放射照相术或MRI(核磁共振成像)检测到腺癌细胞的存在之前,就能够检测到腺癌细胞的存在。

        本发明基于以下发现,即,结肠直肠腺瘤进展为腺癌,通常是由腺瘤细胞中的染色体获得或缺失的出现而导致的。因此,本发明提供了通过间接分析方法检测染色体获得或缺失而检测腺癌的方法和工具。

        根据本发明,与从结肠直肠腺瘤进展为腺癌相关的染色体获得或缺失是通过检测染色体获得或缺失的标记基因的改变的表达水平而间接检测的。

        可以将表达与染色体获得或缺失相关地标记基因分为两类。第一类基因是位于获得或缺失的染色体区域中的那些基因。尽管位于缺失的染色体区域中的基因将不被表达,但细胞中的调节机制可以上调其他完整染色体上的相应基因的表达。与可以预期的相反,并不是位于染色体获得区域上的所有基因都超量表达。因此,仅仅了解染色体获得或缺失区域内的基因的位置还不足以预测基因的表达是否受影响,并且如果受影响,还不足以预测是如何受影响的。第二类基因是这样的基因,即自身不位于染色体获得或缺失的区域中,但其表达受到位于染色体异常上的一个或多个基因的影响。

        本发明提供了标记基因的组合,其允许可靠检测样品中腺癌细胞的存在。

        一方面,本发明公开了标记基因,其以前没有被鉴定为结肠直肠腺瘤细胞进展为癌细胞的标记基因(表17)。

        因此,本发明提供了用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:(a)在该患者的受试样品中检测一种或多种标记基因的表达水平,所述标记基因选自表17中所列的组,和(b)比较用于步骤(a)中的这一种或多种标记基因的表达水平与对照的表达水平。与对照样品相比,受试样品中标记基因表达水平的升高或降低,表明患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。根据一个特定的实施方案,本发明的方法包括检测选自表17中所列的组的一种或多种标记基因的表达水平,其中标记基因是以下这样的基因:与腺瘤细胞相比,其表达在腺癌细胞中上调。

        另一方面,本发明提供了广泛的标记基因列表,使得可以用有代表性的数目的标记基因可靠地确定结肠直肠腺瘤细胞进展为腺癌细胞(表1)。

        因此,本发明提供了用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:(a)在所述患者的受试样品中检测至少12种标记基因的表达水平,所述标记基因选自表1所列的组,和(b)比较用于步骤a)中的标记基因的表达水平与对照样品的表达水平。与对照样品相比,受试样品中这些标记基因表达水平的升高或降低,表明患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        另一方面,本发明公开了标记基因,其表达水平与结肠直肠腺瘤细胞中特定类型的染色体异常的存在相关(表2-9)。

        因此,本发明提供了基于标记基因的检测而检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,所述标记基因的表达与染色体异常的存在相关。更具体地,本发明这方面的方法包括以下步骤:(a)在该患者的受试样品中检测一种或多种标记基因的表达水平,所述标记基因的表达在存在染色体异常时改变,和(b)比较用于步骤(a)中的一种或多种标记基因的表达水平与对照样品的表达水平。与对照样品相比,受试样品中所述一种或多种标记基因表达水平的升高或降低,表明患者中腺癌细胞的存在。

        在本发明这方面的特定实施方案中,所述一种或多种标记基因包括:

        -选自表2中描述的标记基因的两种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体8p上的染色体缺失而改变,和/或,

        -选自表3中描述的标记基因的一种或多种标记基因,其表达水平由于染色体8q上的染色体获得而改变,和/或,

        -选自表4中描述的标记基因的3种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体13q上的染色体获得而改变,和/或,

        -选自表5中描述的标记基因的一种或多种标记基因,其表达水平由于染色体15q上的染色体缺失而改变,和/或,

        -选自表6中描述的标记基因的一种或多种标记基因,其表达水平由于染色体17p上的染色体缺失而改变,和/或,

        -选自表7中描述的标记基因的3种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体18q上的染色体缺失而改变,和/或,

        -选自表8中描述的标记基因的9种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变,和/或,

        -选自表9中描述的标记基因的两种或更多种标记基因,其表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变。

        另一方面,本发明公开了代表与结肠直肠腺癌相关的不同染色体异常的标记基因集合。已知这些异常发生在所有存在的结肠直肠腺癌的至少85%中,由此代表了用于检测腺癌的可靠的筛选测定。

        因此,本发明提供了检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:(a)在该患者的受试样品中检测多种标记基因的表达水平,所述标记基因代表与结肠直肠腺癌相关的染色体异常的存在,和(b)比较用于步骤a)中的多种标记基因的表达水平与对照样品的表达水平。与对照样品相比,受试样品中所述多种标记基因的表达水平的升高或降低,表明患者中腺癌细胞的存在。更具体地,所述多种标记基因包括:

        -选自表2中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平受到染色体8p上的染色体缺失的影响,和

        -选自表3中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体8q上的染色体获得而改变,和

        -选自表4中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体13q上的染色体获得而改变,和

        -选自表5中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体15q上的染色体缺失而改变,和

        -选自表6中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体17p上的染色体缺失而改变,和

        -选自表7中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体18q上的染色体缺失而改变,和

        -选自表8或表9中描述的标记基因的至少一种标记基因,其表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变。

        另一方面,本发明公开了标记基因,其表达水平在结肠直肠腺瘤中存在特定类型的染色体异常时改变,并且其位于该染色体异常内(表10-16)。

        因此,本发明提供了检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:(a)在该患者的受试样品中检测多种标记基因的表达水平,所述标记基因代表与结肠直肠腺癌相关的染色体异常的存在,和(b)比较用于步骤a)中的多种标记基因的表达水平与对照样品的表达水平。与对照样品相比,受试样品中所述多种标记基因表达水平的升高或降低,表明患者中腺癌细胞的存在。更具体地,所述多种标记基因包括:

        -选自表10中描述的标记基因的至少一种位于染色体8p上的染色体缺失区中的标记基因,和

        -选自表11中描述的标记基因的至少一种位于染色体8q上的染色体获得区中的标记基因,和

        -选自表12中描述的标记基因的至少一种位于染色体13q上的染色体获得区中的标记基因,和

        -选自表13中描述的标记基因的至少一种位于染色体15q上的染色体缺失区中的标记基因,和

        -选自表14中描述的标记基因的至少一种位于染色体17p上的染色体缺失区中的标记基因,和

        -选自表15中描述的标记基因的至少一种位于染色体18q上的染色体缺失区中的标记基因,和

        -选自表16中描述的标记基因的至少一种位于染色体20q上的染色体获得区中的标记基因。

        在本发明的上述方法的特定实施方案中,选择使用的标记基因,使得

        -表达水平由于染色体8p上的染色体缺失而改变或位于染色体8p上的染色体缺失区中的所述一种或多种标记基因选自表10中描述的NM_020749、NM_004315、NM_003747、NM_016353、NM_152415、NM_006197、NM_000662、NM_000015、D31887、NM_017884、NM_004462、NM_006765、NM_001715、NM_012331、NM_139167、NM_013354和NM_005144组成的一组标记基因,和/或

        -表达水平由于染色体8q上的染色体获得而改变或位于染色体8q上的染色体获得区中的所述一种或多种标记基因选自表11中描述的NM_138455、NM_032611、NM_032862、AL713790、BC030520、NM_024035、NM_017767、NM_002346、AF289596、NM_012162和AB051475组成的一组标记基因,和/或

        -表达水平由于染色体13q上的染色体获得而改变或位于染色体13q上的染色体获得区中的所述一种或多种标记基因选自表12中描述的NM_145293、NM_005358、U50531、NM_012158、NM_017817、NM_003899、NM_003903、NM_018386、BC008975、NM_023011、NM_001260、NM_006646、U50524、NM_033111、NM_024808、NM_014832、NM_006002、NM_015057、NM_024546、BC026126、NM_006493、NM_018210和NM_017664组成的一组标记基因,和/或

        -表达水平由于染色体15q上的染色体缺失而改变或位于染色体15q上的染色体缺失区中的所述一种或多种标记基因选自表13中描述的NM_030574、NM_004255、NM_002573、AB033025、NM_033240、NM_000126、NM_015079、NM_015969和NM_016073组成的一组标记基因,和/或

        -表达水平由于染色体17p上的染色体缺失而改变或位于染色体17p上的染色体缺失区中的所述一种或多种标记基因选自表14中描述的NM_130766、NM_015721和NM_031430组成的一组标记基因,和/或

        -表达水平由于染色体18q上的染色体缺失而改变或位于染色体18q上的染色体缺失区中的所述一种或多种标记基因选自表15中描述的NM_004715、NM_006701和NM_014913组成的一组标记基因,和/或

        -表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变或位于染色体20q上的染色体获得区中的所述一种或多种标记基因选自表16中描述的NM_016397、NM_018270、NM_006602、NM_080476、NM_017896、NM_006097、NM_021809、NM_018840、NM_003600、NM_017495、NM_007002、NM_016354、NM_014071、NM_002212、NM_003185、NM_152255、NM_022082、NM_018244、NM_014902、NM_032013、NM_020182、NM_006886、NM_020673、BC003122、NM_012325、NM_014183、NM_021100、NM_004738、NM_016045、NM_014054、NM_022105、NM_015666、NM_032527、BC025345、NM_033405、NM_006892、NM_005225、NM_000687、BC035639、NM_018677、NM_006047、NM_016436、NM_015511、NM_016082、NM_007238、NM_003908、NM_003610、NM_153360、NM_080425、NM_000114、NM_001853、NM_144498、NM_017798和NM_012384组成的一组标记基因,更特别选自。权利要求3或4的方法,其中表达水平由于染色体20q上的染色体获得而改变的标记基因选自表16中描述的NM_016397、NM_018270、NM_006602、NM_080476、NM_017896、NM_006097、NM_021809、NM_018840、NM_003600、NM_017495、NM_007002、NM_016354、NM_014071、NM_002212、NM_003185、NM_152255、NM_022082、NM_018244、NM_014902、NM_032013、NM_020182、NM_006886、NM_020673、BC003122、NM_012325、NM_014183、NM_021100、NM_004738、NM_016045、NM_014054、NM_022105、NM_015666、NM_032527、BC025345和NM_033405组成的一组标记基因。

        本发明进一步公开了一个标记基因集合,其表达水平的差异与3种、4种或甚至5种不同的染色体异常相关(表18)。

        因此,本发明提供了用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:(a)在所述患者的受试样品中检测选自表18中描述的标记基因的一种或多种标记基因的表达水平,和(b)比较用于步骤(a)中的这些标记基因的表达水平与对照样品的表达水平。与对照样品相比,受试样品中这一种或多种标记基因的表达水平的升高或降低,表明患者中腺癌细胞的存在。

        上文描述的本发明的方法的特定实施方案涉及这样的方法,即,其中基于标记基因的p值或FDR值进一步选择标记基因。更特别地,如表1-9指出的,标记基因具有小于0.05,更特别是小于0.01的p或FDR值。

        上文描述的本发明的方法的进一步特定实施方案涉及这样的方法,即,基于腺癌和腺瘤细胞之间的表达差异的大小,进一步选择标记基因。更特别地,选择这样的标记基因,即根据表2-9,表示为表达水平的差异为至少‘2’,更特别为至少‘4’。

        典型地,在本发明的体外方法中,受试样品是包含或怀疑包含结肠直肠病变的细胞的样品。在一个实施方案中,受试样品是来自结肠直肠病变的活检或切除术的样品?;蛘?,受试样品选自尿、血液、唾液、汗液和粪便的样品。

        在本发明方法的特定实施方案中,对照样品是包含结肠直肠腺瘤细胞(而不是结肠直肠癌细胞)的患者的相同组织的样品。在一个替代实施方案中,对照样品是腺瘤标准物。

        在一个特别优选的实施方案中,本发明涉及用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:

        a)在所述患者的受试样品中检测至少表8、9或16的标记基因NM_017495和NM_006602的表达水平,和

        b)比较用于步骤a)中的所述标记基因的表达水平与对照样品的表达水平,

        其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少两种标记基因表达水平的升高,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        本发明的这种优选方面的进一步的阐述涉及权利要求1的体外方法,包括以下步骤:

        a)在所述患者的受试样品中检测至少表8、9或16的标记基因NM_017495、NM_006602、NM_018840、NM_003600、NM_018270、NM_007002和NM_016397的表达水平,和

        b)比较用于步骤a)中的所述标记基因的表达水平与对照样品的表达水平,

        其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少7种标记基因表达水平的升高,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        所述方法使得能够在检查的至少85%,优选至少88%的病例中正确分类和区分腺瘤与腺癌。

        在本发明的体外方法的特定实施方案中,在DNA或RNA水平确定表达水平。替代实施方案包括在蛋白水平确定标记基因表达。

        本发明的方法特别适于诊断结肠直肠腺瘤进展为结肠直肠腺癌。

        本发明的另一方面提供了用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,其中包含用于特异性检测标记基因的试剂,所述标记基因的表达表明腺癌细胞的存在。所述试剂任选用标记物官能化,所述标记物例如选自下组的标记物:放射性标记物、磁性标记物、MRI造影标记物、发色标记物和超声标记物。在一个特定实施方案中,试剂盒包含用于特异性检测表1中描述的标记基因中的至少12种标记基因的表达的试剂。

        或者,提供了用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,其中包含用于特异性检测表17中描述的标记基因中的至少一种标记基因的表达的试剂。

        本发明的特定实施方案涉及用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,其中包含用于特异性检测一种或多种标记基因的表达的试剂,所述试剂盒包含:

        -用于特异性检测选自表2中描述的标记基因的3种或更多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表3中描述的标记基因的一种或多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表4中描述的标记基因的两种或更多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表5中描述的标记基因的一种或多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表6中描述的标记基因的一种或多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表7中描述的标记基因的3种或更多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表8中描述的标记基因的7种或更多种标记基因的试剂,和/或,

        -用于特异性检测选自表9中描述的标记基因的7种或更多种标记基因的试剂。

        本发明的试剂盒的进一步的实施方案涉及用于检测结肠直肠腺癌细胞的试剂盒,其中包含用于特异性检测下组中每一组中至少一种标记基因的表达的试剂的集合:表2中描述的标记基因、表3中描述的标记基因、表4中描述的标记基因、表5中描述的标记基因、表6中描述的标记基因、表7中描述的标记基因、表8中描述的标记基因和表9中描述的标记基因。

        上文描述的本发明的试剂盒的其他特定实施方案提供了用于特异性检测标记基因的试剂,其中根据表1-9,所述标记基因具有小于0.05,更特别是小于0.01的p或FDR值。

        上文描述的本发明的试剂盒的其他特定实施方案提供了用于特异性检测标记基因的试剂,其中根据表2-9或17,所述标记基因在腺瘤和腺癌细胞之间的表达水平差异是至少‘2’,更特别是至少‘4’。

        在本文描述的试剂盒的其他特定实施方案中,所述试剂是寡核苷酸或抗体。寡核苷酸任选排列在支持物上。本文描述的试剂盒的其他特定实施方案涉及包含抗体的试剂盒,其中所述抗体结合于标记基因编码的蛋白。在一个特定实施方案中,抗体结合于标记基因编码的蛋白,从而所述蛋白是分泌的蛋白或细胞表面上的蛋白。

        本发明的另一方面涉及用于检测患者的结肠直肠组织中的腺癌细胞的体内方法。

        更具体地,本发明提供了用于检测结肠直肠病变中的腺癌细胞的体内方法,所述方法包括以下步骤:使结肠直肠病变与标记的试剂接触,所述试剂能够与选自表17中描述的基因的标记基因表达的蛋白特异性结合或相互作用,和(b)检测该试剂与所述结肠直肠病变的结合或相互作用。检测到结肠直肠病变的病灶内所述试剂的结合或相互作用的差异,表明病变中腺癌细胞的存在。

        在特定实施方案中,用于本发明的体内方法中的标记基因是编码位于细胞膜上的蛋白、分泌的蛋白或酶的基因。

        因此,本发明提供了与表17或18中描述的标记基因特异性结合或相互作用的试剂,用作检测结肠直肠腺瘤组织中腺癌细胞的存在的体内诊断剂。

        因此,本发明也涉及与表17或18中描述的标记基因特异性结合或相互作用的试剂在制备诊断剂中的用途,所述诊断剂用于检测结肠直肠肿瘤组织中腺癌细胞的存在。

        从下文的详细描述,可以明确本发明的上述和其他特征、特性和优点。这种描述仅仅是出于举例的目的,而不限制本发明的范围。

        发明详述

        将参照特定实施方案并参照某些附图描述本发明,但本发明不限于此,而仅仅由权利要求限定。权利要求中的任何参照标记不应该解释为限制范围。描述的附图仅仅是示意性的,不是限制性的。在附图中,出于示意的目的,可以扩大某些元素的大小,并不是按比例尺绘制的。当术语“包含”用于本说明书和权利要求中时,它并不排除其他元素或步骤。当使用不确定或确定物体时在提到单数名词如“一个”或“一种”、“该”时,这包括该名词的复数,除非特别指出了其他含义。

        此外,说明书和权利要求中的术语“第一、第二和第三”等是用于区分相似元素,不一定是描述顺序或年代次序。要理解的是,如此使用的术语在合适的环境下是可互换的,并且本文描述的发明的实施方案能够以本文描述或说明的顺序之外的顺序操作。

        提供以下术语或定义,仅仅是为了帮助理解本发明。这些定义不应该解释为具有小于本领域普通技术人员理解的范围。

        定义

        本文用到的术语“肿瘤”或“赘生物”是指通过比正常情况更迅速的细胞增殖而生长,并且在起始新的生长的刺激停止后继续生长的异常组织。术语“病变”通常是指由于任何疾病或任何损伤导致的累及任何组织或器官的异常,其在本文中也用于表示赘生物。肿瘤、赘生物或病变可以是良性或恶性的。

        “癌症”是表示任何类型的恶性赘生物的常用术语。

        本文用到的“腺瘤”(或未进展的腺瘤)涉及良性上皮赘生物。腺瘤通常是分界清楚的,它们可以是扁平或息肉样的,并且赘生细胞不浸润或侵入邻近组织。

        本文用到的“腺癌”是指上皮细胞的恶性赘生物。最常见的癌的形式是腺体或腺体样模式。同义词是“腺癌(glandular?cancer)”和“腺癌(glandular?carcinoma)”。恶性细胞的特征通常在于进行性和不受控制的生长。它们可以局部传播或通过血流和淋巴系统传播到身体的其他部分。

        “进展的腺瘤”是指具有癌病灶的腺瘤。这也称作“恶性息肉”。结肠直肠腺瘤在老年群体中是常见的,但这些恶性前肿瘤中仅仅一小部分(估计大约5%)进展到恶性肿瘤(即结肠直肠腺癌)。

        “结肠直肠”是指结肠和/或直肠,即整个大肠。

        本文用到的“染色体异?!笔侵溉旧迦笔Щ蚧竦?,即,染色体中缺失或重复的区域。

        本文用到的“标记基因”是这样一种基因,即,其表达在腺瘤和腺癌细胞之间不同(减少或增加),并且因此其可以用于区分腺瘤和腺癌细胞。

        “表达概况”是指细胞或样品中一些标记基因的表达水平。

        本发明提供了用于区分恶性和良性结肠直肠病变和用于诊断受试者中结肠直肠癌的存在的诊断方法和工具。本发明的诊断方法使得能够可靠检测非常早期的结肠直肠癌。

        本发明的一方面涉及用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括在所述患者的受试样品中检测一种或多种标记基因的表达水平。将标记基因的表达水平与对照样品的表达水平进行比较,其中与对照样品中的表达水平相比,受试样品中标记基因表达水平的差异,表明患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        一般地,用于本发明的方法中的标记基因在腺瘤和癌细胞之间是差异表达的??梢曰诓钜斓拇笮?,即,腺癌样品中发生的标记基因上调或下调的程度(如2倍、4倍或8倍,或甚至更多)进行进一步的选择。表达水平在表中的“作用”标题下表示为log-2值。因此,等于1的值表示与腺瘤相比,腺癌中的基因表达高2倍,等于2的指是指高4倍的表达,等于3的值是指高8倍的表达,等等。类似地,等于-1的值表示与腺瘤相比,腺癌中的基因表达低2倍,等于-2的指是指低4倍的表达,等于-3的值是指低8倍的表达,等等?;蛘?,也可以基于腺瘤和癌细胞中标记基因的差异表达的统计学显著性的计算(用p-值或FDR(假发现率)值)而进行标记基因的进一步选择。在特定实施方案中,采用这两种选择标准。

        在本发明的一个实施方案中,通过确定一种或多种标记基因的表达而鉴定患者中腺癌细胞的存在,其中在比较腺瘤和腺癌细胞时,所述标记基因的表达改变(增加或减少)超过2倍、4倍或8倍,和/或所述标记基因在腺瘤或腺癌细胞的标记基因表达和存在之间的关联的p-值小于0.01(是统计学显著的)。

        可以通过任何临床上可接受的方式采集用于本发明的体外方法中的检测的样品,但是采集的方式使得保留核酸(特别是RNA)或蛋白。根据本发明分析的样品通常是结肠直肠活检物或切除物。来自肿瘤组织的完整细胞或裂解的细胞也可以在不干预的情况下从结肠分离,并且将终止于粪便中。因此,粪便样品也认为是用于分离RNA的合适来源。此外,结肠直肠腺癌细胞可以迁移到其他组织中。因此,也可以使用血液和其他类型的样品。由于目的在于尽早检测结肠直肠腺瘤进展为腺癌,活检物或切除物可能含有大量腺瘤细胞和仅仅少量腺癌细胞。为了增加信号/背景比,可以将切除物在分析之前分为不同的子样品。即使活检物或切除物中的癌细胞总数是有限的,可以预期,至少子样品之一中将含有升高的腺癌与腺瘤细胞的比例。

        在本发明的体外方法中,在患者的样品中在RNA或蛋白水平确定一种或多种标记基因的表达,并且与对照样品中这些基因的表达进行比较。对照样品可以是来自相同患者的腺瘤样品?;蛘?,对照样品是获自其他个体或获自来自一个或多个其他个体的结肠直肠腺瘤的合并样品的腺瘤样品。也可以通过合并核酸或蛋白的集合而模拟结肠直肠腺瘤组织的RNA/蛋白含量,从而人工制备对照。

        在第一个实施方案中,特征在于与对照如结肠直肠腺瘤细胞相比,在结肠直肠腺癌细胞中上调或下调的标记基因选自表1。尽管表1列出的任何标记基因都适用于本发明的用于鉴定样品中结肠直肠腺癌细胞的存在的方法中,本发明的一个重要的优点是提供了合适标记物的广泛列表,从而使得检测的可靠性增加。因此,本发明的特定实施方案涉及使用表1的标记基因中的至少2种、至少5种、至少10、12或15种、至少20种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种或全部。在一个特定实施方案中,使用表1的标记基因的一个子集,即表1中p值小于0.01的标记基因。

        在另一实施方案中,特征在于与对照如结肠直肠腺瘤细胞相比,在结肠直肠腺癌细胞中上调或下调的标记基因选自表1。表17的标记基因以前都没有被鉴定为结肠直肠腺癌的标记基因,并且表17的每种标记基因都适用于本发明的用于鉴定样品中结肠直肠腺癌细胞的存在的方法中。在特定实施方案中,在患者样品中确定表17鉴定的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种基因的表达,并且与对照进行比较,以鉴定患者中腺癌细胞的存在。

        根据本发明方法的另外的实施方案,使用表1的标记基因的子集,其表达水平与结肠直肠肿瘤细胞中的特定染色体异常直接相关。

        在一个实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体8p上发生染色体缺失时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表2。因此表2中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具中,使用表2的标记基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种、至少200种或全部。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表2的子集,即表2中FDR(假发现率)值小于0.05或更特别小于0.01的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表2的子集,所述子集相应于与腺癌细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表2的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以建立标记基因的子集,所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.05或小于0.01。

        在另一实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体8q上发生染色体获得时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表3。因此表3中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具中,使用表3的标记基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少20种或全部。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表3的子集,即表3中FDR(假发现率)值小于0.05或更特别小于0.01的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表3的子集,所述子集相应于与腺癌细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表3的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以从表3建立标记基因的子集,所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.05或小于0.01。

        在另一实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体13q上发生染色体获得时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表4。因此表4中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具的一个实施方案中,使用表4的标记基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种或全部。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表4的子集,即表4中FDR(假发现率)值小于0.05或更特别小于0.01的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表4的子集,所述子集相应于与腺癌细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表4的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以从表4建立标记基因的子集,所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.05或小于0.01。

        在另一实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体15q上发生染色体缺失时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表5。因此表5中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具的特定实施方案中,使用表5的标记基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种或全部。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表5的子集,即表5中FDR(假发现率)值小于0.05或更特别小于0.01的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表5的子集,所述子集相应于与腺瘤细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表5的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以从表5建立标记基因的子集,所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.05或小于0.01。

        在另一实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体17p上发生染色体缺失时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表6。因此表6中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具的特定实施方案中,使用表6的标记基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少6种或全部。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表6的子集,即表6中FDR(假发现率)值小于0.1的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表6的子集,所述子集相应于与腺瘤细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表6的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以从表6建立标记基因的子集,所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.1。

        在另一实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体18q上发生染色体缺失时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表7。因此表7中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具的特定实施方案中,使用表7的标记基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种、至少200种或全部。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表7的子集,即表7中FDR(假发现率)值小于0.05或更特别小于0.01的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表7的子集,所述子集相应于与腺瘤细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表7的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以从表7建立标记基因的子集,所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.05或小于0.01。

        在另一实施方案中,本发明提供了一个标记基因集合,当结肠直肠腺瘤细胞中染色体20q上发生染色体获得时,所述标记基因的表达水平改变。这些标记基因列于表8和9,其中表8的数据来自单变量分析,表9的数据来自多变量分析。因此表8或9中列出的任何标记基因都可以用于本发明的用于鉴定结肠直肠腺癌细胞的方法和工具中。在本发明的方法和工具的特定实施方案中,使用表8或9的标记基因中的至少1种、至少2种、至少4种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少50种、至少100种、至少200种、至少400种、至少600种或全部。额外或替代地,使用的标记基因选自表8或9的子集,即表8或9中FDR值小于0.05或更特别小于0.01的那些标记基因。额外或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表8或9的子集,所述子集相应于与腺瘤细胞相比,在腺癌细胞中的表达水平增加的那些标记基因。额外或替代地,标记基因选自表8或9的子集,所述子集相应于在腺瘤和腺癌细胞中的表达水平相差至少因数2、至少因数4或至少因数8的那些标记基因。同样,可以从表8或9建立标记基因的子集,其中所述标记基因在腺瘤和腺癌之间的表达水平的差异(增加或减少)至少是因数2、4或8,并且其FDR值小于0.05或小于0.01。

        在一个特别优选的实施方案中,本发明涉及用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法,该方法包括以下步骤:

        a)在所述患者的受试样品中至少检测表8、9或16的标记基因NM_017495和NM_006602的表达水平,和

        b)比较用于步骤a)中的所述标记基因的表达水平与对照样品的表达水平,

        其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少两种标记基因表达水平的升高,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        本发明的这种优选方面的进一步的细节涉及权利要求1的体外方法,包括以下步骤:

        a)在所述患者的受试样品中至少检测表8、9或16的标记基因NM_017495、NM_006602、NM_018840、NM_003600、NM_018270、NM_007002和NM_016397的表达水平,和

        b)比较用于步骤a)中的所述标记基因的表达水平与对照样品的表达水平,

        其中与所述对照样品相比,所述受试样品中所述至少7种标记基因表达水平的升高,表明所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        在超过50%或甚至超过60%的病例中可以在结肠直肠腺瘤细胞中观察到染色体臂20q的获得。对于所述染色体臂20q的获得,发现与腺瘤相比,上述表8、9或16的标记基因NM_017495、NM_006602、NM_018840、NM_003600、NM_018270、NM_007002和NM_016397在腺癌中超量表达,使得能够在至少85%,优选至少88%检查的病例中区分腺瘤与腺癌。

        上述列于表2-9中的标记基因集合包括与特定类型的染色体异常相关的标记基因。但是,也可能某些基因受到不同染色体异常的上调。因此,表2-9显示了某种程度的冗余。在表2-9中出现1次以上的标记基因特别适用于本发明的方法中,因为它们是“一种”染色体异常的存在的更普遍的特征。表达水平由3、4或5种不同的染色体异常而改变的标记基因列于表18。因此,本发明的方法的特定实施方案涉及使用表18的标记基因中的至少1种、至少2种、至少4种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少50种、至少100种、至少200种、至少400种、至少600种或全部,用于鉴定患者中的结肠直肠腺癌细胞。额外地或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自表18的子集,其相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        本发明不仅提供了在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的标记基因,也进一步将这种差异表达与染色体异常的存在进行关联。这使得能够用代表每种染色体异常的标记基因集合来开发诊断工具。

        因此,进一步的特定实施方案涉及标记基因集合,其包括表明每种染色体异常的标记基因。更特别地,所述标记基因集合包括:

        -至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或更多种选自表2的标记基因(与8p缺失相关的标记基因)和

        -至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或更多种选自表2的标记基因(与8q获得相关的标记基因)和

        -至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或更多种选自表4的标记基因(与13q获得相关的标记基因)和

        -至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或更多种选自表5的标记基因(与15q缺失相关的标记基因)和

        -至少1种、至少2种、至少5种、10种或更多种选自表6的标记基因(与17p缺失相关的标记基因)和

        -至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或更多种选自表7的标记基因(与18q缺失相关的标记基因)和

        -至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或更多种选自表8或9的标记基因(与20q获得相关的标记基因)。

        额外地或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自上文列出的标记基因集合的子集,其相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在结肠直肠腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        在本发明的其他实施方案中,用于本发明的方法和工具中的、表明每种染色体异常的标记基因的集合包含位于自身获得或缺失的染色体区内的基因。因此,标记基因的集合包括:

        -表10中列出的与8p上的染色体缺失相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或全部。更特别地,一种或多种标记基因选自NM_020749和NM_004315和/或NM_003747、NM_016353、NM_152415、NM_006197、NM_000662、NM_000015和D31887,和

        -表11中列出的与8q上的染色体获得相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或全部。更特别地,一种或多种基因选自NM_138455、NM_032611、NM_032862,和

        -表12中列出的与13q上的染色体获得相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或全部,特别是NM_145293和/或NM_005358。更特别地,一种或多种基因选自U50531、NM_012158、NM_017817、NM_003899、NM_003903、NM_018386、BC008975和NM_023011,和

        -表13中列出的与15q上的染色体缺失相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或全部。更特别是NM030574,或一种或多种基因选自NM_004255、NM_002573和AB033025。

        -表14中列出的与17p上的染色体缺失相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或全部。更特别地,一种或多种基因选自NM_130766、NM_015721和NM_031430,和

        -表15中列出的与18q上的染色体缺失相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种或全部。更特别地,一种或多种标记基因选自NM_004715、NM_006701和NM_014913,和

        -表16中列出的与20q上的染色体获得相关的基因中的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种、至少25种、至少50种、至少100种或全部。更特别地,一种或多种标记基因选自NM_016397和NM_018270和NM_006602。其他特定的标记基因是NM_080476和NM_017896之一或这两者。其他特定的标记基因是选自NM_006097、NM_021809、NM_018840、NM_003600、NM_017495、NM_007002和NM_016354的一种或多种。其他特定的标记基因是选自NM_014071、NM_002212、NM_003185、NM_152255和NM_022082的一种或多种。其他特定的标记基因是选自NM_018244、NM_014902、NM_032013、NM_020182、NM_006886、NM_020673和BC003122的一种或多种。

        额外地或替代地,用于本发明的方法中的标记基因选自上文列出的基因的子集,其相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在结肠直肠腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        一般地,上文描述的标记基因在用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法中使用,该方法包括以下步骤:在该患者的受试样品中检测上文的集合和子集中定义的一种或多种标记基因的表达水平,比较使用的标记基因的表达水平与对照样品(如结肠直肠腺瘤细胞)的表达水平。与对照样品相比,受试样品中使用的标记基因表达水平的升高或降低,表明患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

        本发明的标记基因用于基于DNA、RNA或蛋白的表达分析中。本发明的标记基因的显著优点是它们适用于客观的定量诊断中?;谙钟屑际踔屑ǖ谋昙堑姆椒ㄊ怯邢薜?,因为它们依赖于少量包含癌细胞的组织学样品的检查。

        在一个特定的实施方案中,标记基因用于基于DNA或RNA的表达分析中,所述分析提供了灵敏度提高的优点,这是基于DNA或RNA的诊断学的典型特点。本发明的方法和标记基因使得能够在致癌过程的非常早的阶段区分结肠直肠腺瘤与腺癌细胞。

        可以通过本领域已知的方法实现患者样品中标记基因表达水平的确定。例如,可以通过以下步骤评估各种标记基因的表达:分离获自琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的核酸分子(如RNA或cDNA),然后与标记基因特异性寡核苷酸探针杂交?;蛘?,可以通过以下步骤确定表达水平的差异:标记获自样品的核酸,然后在测序凝胶上分离。将核酸样品置于凝胶上,使得患者和对照或标准核酸位于相邻泳道上。肉眼或通过密度计的方式实现表达水平的比较。

        在一个特定实施方案中,通过与DNA阵列(也称作“微阵列”或“DNA芯片”)杂交,同时评估用于阵列中的所有标记基因的表达。例如,可以通过″微阵列生物芯片技术″(Schena?M.,Eaton?Publishing,2000)中公开的方法进行基于微阵列的表达概况分析。DNA阵列包含固定的高密度探针,用于检测一些基因。阵列上的探针与标记基因的序列的一个或多个部分互补,或与标记基因的整个编码区互补。在本发明中,任何类型的多核苷酸都可以用作用于DNA阵列的探针。典型地,cDNAs、PCR产物和寡核苷酸都可以用作探针。因此,可以通过单轮分析,同时评估多个基因的表达水平。

        基于DNA阵列的检测方法通常包括以下步骤:

        1)从样品分离mRNA,任选将mRNA转化为cDNA,随后标记该RNA或cDNA。用于分离RNA、将其转化为cDNA以及用于标记核酸的方法描述于微阵列技术手册中。

        2)使来自步骤1的核酸与标记基因的探针杂交??梢杂萌玖?,如荧光染料Cy3(红色)或Cy5(蓝色)对来自样品的核酸进行标记。通常,对照样品用不同的染料进行标记。

        3)检测来自样品的核酸与探针的杂交,并且至少定性,更特别是定量确定研究的不同标记基因的样品中mRNA的量??梢曰谛藕徘慷鹊牟钜?,评估样品和对照之间的表达水平的差异。这些可以通过合适的软件测量和分析,例如但不限于例如Affymetrix提供的软件。

        在一个特定实施方案中,可以例如根据与特定类型的染色体异常相关的标记基因来排列阵列上的探针?;蛘?,可以开发不同的阵列,每个阵列携带用于检测特定类型的染色体异常的探针。

        对相应于点样在DNA阵列上的标记基因的探针数目没有限制。例如,可以选择本发明的任何标记基因集合中的1%或更多,5%或更多,20%或更多,50%或更多,70%或更多。同样,标记基因可以由与基因的不同部分杂交的两种或多种探针代表。为每种选择的标记基因设计探针。所述探针典型地是包含5-50个核苷酸残基的寡核苷酸??梢酝ü齈CR或化学合成更长的DNAs。用于合成所述寡核苷酸,并且将其用于基质上的方法是微阵列领域公知的。

        除了标记基因之外的基因也可以点样在DNA阵列上。例如,可以将表达水平不显著改变的基因的探针点样在DNA阵列上,从而使测定结果标准化,或比较多个阵列或不同测定的测定结果。

        在本发明的方法的特定实施方案中,通过确定代表性的标记基因表达的蛋白量,评估特定标记基因的表达水平。对于蛋白水平的分析,原则上可以使用本发明描述的每种标记基因,但一些蛋白可能较不适用,这是因为诸如有限的溶解度、非常高或小的分子量或极端等电点等因素。

        例如可以通过以下步骤实现蛋白水平的标记基因表达水平的确定:在聚丙烯酰胺凝胶上从样品分离蛋白,然后在蛋白印迹中用抗体鉴定特异性标记基因得到的蛋白?;蛘?,可以通过二维凝胶电泳系统分离蛋白。二维凝胶电泳是本领域公知的,并且典型地包括沿第一维等电聚焦,随后是沿第二维SDS-PAGE电泳??梢酝ü范荷系鞍椎愕那慷冉?D?SDS-PAGE凝胶的分析,或可以用免疫检测进行。在其他实施方案中,通过质谱分析蛋白样品。

        用于体外测定中的样品通常是结肠直肠活检物或切除物,更特别是腺瘤样息肉活检物或切除物。对于体外蛋白表达分析,可以使用活检物或切除物的细胞或细胞裂解物。因此,细胞中蛋白的定位或要分析的蛋白的功能对于分析不重要。预期患者中腺癌细胞的存在由腺癌细胞分泌的某些蛋白水平升高或降低的存在而反映。所述蛋白可以存在于身体的血液、尿、汗和其他部分中。同样,腺癌细胞将蛋白释放到结肠腔中。此外,完整的腺癌细胞或它们的裂解的内容物可以释放到肠道中,并且将存在于粪便中,其可以用作体外蛋白分析的来源。但是,与核酸相反,蛋白不能被扩增。因此,预期在特定实施方案中,本发明的方法包括富集步骤,特别是腺癌材料的富集。例如,样品可以与例如用磁性颗粒官能化的腺瘤和腺癌细胞的细胞膜或细胞器的特异性配体接触。通过磁性颗粒浓缩的材料随后可以进行分析,用于检测标记蛋白。

        在本发明的另一方面,本发明的标记基因用于体内分析中的结肠直肠腺瘤和腺癌的区别检测。因此,本发明提供了用于在结肠直肠腺瘤组织中检测腺癌细胞的体内方法,所述方法包括以下步骤:

        -使能够与标记基因表达的蛋白特异性结合或相互作用的经标记的试剂与结肠直肠病变接触,和

        -检测所述经标记的试剂与病变中的细胞的结合或相互作用;

        其中检测到病变中特征在于经标记的试剂的结合或相互作用的差异的病灶,表明结肠直肠腺瘤中腺癌细胞的存在。

        本发明提供了标记基因集合,其以前没有鉴定为结肠直肠腺癌的标记物,并且可以用于本发明的体内方法中(在表17中显示)。这些标记中的任何一种都适用于本发明的体内诊断方法。本发明的一个特定实施方案提供了标记基因的集合,其选自表17的子集;相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在结肠直肠腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        在本发明的方法的一个特定实施方案中,分析了标记基因的集合,从而增加检测的可靠性。更特别地,根据一个特定实施方案,使用试剂的集合,从而每种试剂检测与不同类型的染色体异常相关的标记物,所述染色体异常与结肠直肠腺癌相关。

        因此,根据一个实施方案,一个标记基因集合用于体内鉴定癌细胞的存在,该标记基因集合包括表明每种染色体异常的标记基因。更特别地,该标记基因集合包括:

        -一种或多种选自表2的基因(与8p缺失相关的标记基因)和

        -一种或多种选自表3的基因(与8q缺失相关的标记基因)和

        -一种或多种选自表4的基因(与13q获得相关的标记基因)和

        -一种或多种选自表5的基因(与15q缺失相关的标记基因)和

        -一种或多种选自表6的基因(与17p缺失相关的标记基因)和

        -一种或多种选自表7的基因(与18q缺失相关的标记基因)和

        -一种或多种选自表8或9的基因(与20q获得相关的标记基因)。

        额外地或替代地,提供了用于本发明的体内方法中的标记基因的集合,其选自上文描述的标记基因集合,相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在结肠直肠腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        在本发明的体内诊断方法的其他实施方案中,表明每种染色体异常的标记基因集合包含位于获得或缺失的染色体区自身内的基因。因此,标记基因的集合包括:

        -选自表10列出的标记基因的一种或多种基因。更特别地,一种或多种标记基因选自NM_020749和NM_004315和/或选自NM_003747、NM_016353、NM_152415、NM_006197、NM_000662、NM_000015和D31887,和

        -选自表11列出的标记基因的一种或多种基因。更特别地,一种或多种基因选自NM_138455、NM_032611、NM_032862,和

        -选自表12列出的标记基因的一种或多种基因,特别是NM_145293和/或NM_005358。更特别地,一种或多种基因选自U50531、NM_012158、NM_017817、NM_003899、NM_003903、NM_018386、BC008975和NM_023011,和

        -选自表13列出的标记基因的一种或多种基因。更特别是NM030574,或一种或多种基因选自NM_004255、NM_002573和AB033025。

        -选自表14列出的标记基因的一种或多种基因。更特别地,一种或多种基因选自NM_130766、NM_015721和NM_031430,和

        -选自表15列出的标记基因的一种或多种基因。更特别地,一种或多种标记基因选自NM_004715、NM_006701和NM_014913,和

        -选自表16列出的标记基因的一种或多种基因。更特别地,一种或多种标记基因选自NM_016397和NM_018270和NM_006602。其他特定的标记基因是NM_080476和NM_017896之一或这两者。其他特定的标记基因是选自NM_006097、NM_021809、NM_018840、NM_003600、NM_017495、NM_007002和NM_016354的一种或多种。其他特定的标记基因是选自NM_014071、NM_002212、NM_003185、NM_152255和NM_022082的一种或多种。其他特定的标记基因是选自NM_018244、NM_014902、NM_032013、NM_020182、NM_006886、NM_020673和BC003122的一种或多种。

        额外地或替代地,提供了用于本发明的体内方法中的标记基因集合,其选自上文描述的标记基因集合,相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在结肠直肠腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        本发明的数据分析显示通过不同的染色体异常,可以导致一种标记基因的表达改变。表18显示了由于3种、4种或甚至5种不同异常而改变的标记基因。根据一个特定实施方案,用选自表18列出的标记基因的一种或多种标记基因实施本发明的体内方法。额外地或替代地,用选自表18列出的标记基因的一种或多种标记基因实施本发明的体内方法,所述标记基因相应于与腺瘤细胞相比,表达水平在结肠直肠腺癌细胞中升高的那些标记基因。

        消化道很容易接触患者中诊断化合物的施用。此外,可以用结肠镜检测经标记的化合物。体内诊断技术进一步允许分析不同的息肉,而不需要采集个体的活检物。

        特别适用于体内成像的标记基因是编码位于细胞表面或被分泌的蛋白的标记基因?;蛘?,预期由标记基因编码的蛋白的检测是针对保留在细胞质或细胞核中的蛋白??梢酝ü固?、结合肽/蛋白(如受体配体或其部分)检测蛋白,如果合适,通过代谢物、酶底物、底物类似物和酶抑制剂检测蛋白??梢杂猛ü赴诨幕衔?,如掺入细胞内的酶底物或类似物、酶抑制剂或某些代谢物间接检测位于细胞内的许多蛋白。因此,通过检测与腺瘤细胞相比,由标记基因编码的蛋白表达或活性的减少或增加,可以体内鉴定腺癌细胞。

        用发色剂、MRI标记物、用于超声检测的标记物、放射性化合物或促进体内成像的其他工具,可以对任何上文描述的适用于体内检测蛋白的化合物进行进一步官能化。

        本发明的另一方面涉及用于进行本发明的体内和/或体外检测方法的试剂盒。典型地,本发明的试剂盒含有一种或多种使得能够特异性检测本文公开的一种或多种标记基因的试剂。在一个特定实施方案中,试剂盒包含试剂集合,其允许检测本文描述的标记基因集合。通过试剂盒所适用的检测方法,确定试剂的性质。当意欲用于在DNA/RNA方法中的检测时,试剂典型地是标记物特异性的引物或探针,它们是任选标记的。当检测是在蛋白水平时,试剂典型是含有抗体的抗原结合片段的抗体或化合物。但是,如上文描述的,可以用其他化合物检测蛋白表达,所述其他化合物与感兴趣的标记物特异性相互作用,所述标记物如特异性底物(在酶的情况下)或配体(用于受体)。

        在特定实施方案中,根据本发明的方法,本发明的试剂盒也包含对照样品。

        在所附独立和从属权利要求中阐述了本发明的特定和优选方面。从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征以及合适的其他独立权利要求的特征组合,并且不仅仅是权利要求中特意阐述的那些。

        实施本发明的其他系统和方法的安排对于本领域技术人员是显而易见的。

        应该理解,尽管本文讨论了用于本发明的装置的优选实施方案、特定构造和构型,但可以进行形式和细节的各种改变或修饰,而不背离本发明的范围和精神。

        实施例

        实施例1:在微阵列中确定差异表达的基因

        选择肿瘤样品

        在荷兰阿姆斯特丹的VU-大学医学中心(VUmc)前瞻性采集73个快速冷冻的结肠直肠肿瘤(37个未进展的腺瘤和36个癌)。所有样品都根据伦理委员会的规定使用。

        所述73个冷冻标本相应于65个患者(31个女性和34个男性)。在这些患者中,6个患者具有多发性肿瘤:4个患者具有多发性腺瘤,2个患者具有一个或多个相邻于癌的腺瘤?;颊叩钠骄炅涫?9岁(范围是47-89岁)。

        在冷冻设备上进行阵列-CGH和表达微阵列。

        RNA分离

        按照供应商的说明书,用TRIzol试剂(Invitrogen,Breda,NL)从快速冷冻的组织分离RNA。在Nanodrop?ND-1000分光光度计(Isogen,IJsselstein,NL)中测量RNA和DNA浓度和纯度,在用溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶中评估完整度。

        表达微阵列

        a)阵列平台

        从Sigma-Genosys(Zwijndrecht,荷兰)获得Compugen(San?Jose,CA,USA)设计的Human?Release?2.0寡核苷酸文库,其中含有代表28830种独特基因的60聚体寡核苷酸。以10mM浓度将寡核苷酸溶解于50mM磷酸钠缓冲液pH?8.5中,并且采用装备了SMP3针(TeleChemInternational,Sunnyvale,CA,USA)的100微阵列(GenomicSolutions,Ann?Arbor,MI,USA),单个点样到CodelinkTM载玻片(Amersham?Biosciences,Roosendaal,NL)上。印刷后,根据制造商的方案(CodelinkTM?slides;Amersham?BioSciences,Roosendaal,NL),处理载玻片。

        b)标记和杂交

        首先,以寡-dT为引物(Isogen,IJsselstein,NL),用SuperScriptTMII逆转录酶(Invitrogen,Breda,NL)将30μg信使RNA逆转录为cDNA。在具有有限量的RNA的样品中,较少量用作起始材料,但至少15μg。将cDNA偶联于Fluorolink?Cy3和Cy5单官能染料5-包(AmershamBioSciences,Rosendaal,NL)?;旌螩y3标记的肿瘤cDNA和Cy5标记的参照cDNA,通过加入0.1体积的3M乙酸钠(pH?5.2)和2.5体积的冰冷的100%乙醇,用12μg?pd(A)40-60(Amersham?BioSciences,Rosendaal,NL),60μg?tRNA(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,NL)和24μg人Cot-1DNA(Invitrogen,Breda,NL)共沉淀。通过4℃下以14,000rpm离心10分钟而收集沉淀物。在空气中干燥后,将沉淀物溶解于与终浓度为50%的甲酰胺,2x?SCC,10%硫酸葡聚糖和4%SDS的126.7μl杂交混合物中。将cDNA样品在73℃下变性10分钟,然后37℃下温育60分钟,以使得Cot-1DNA能够封闭重复序列。用变性和封闭的杂交混合物将阵列在杂交站(HybArrayl2TM-Perkin?Elmer?LifeSciences,Zaventem,BE)中37℃下温育14小时。杂交后,45℃下在含有50%甲酰胺,2x?SCC,pH?7的溶液中将载玻片洗涤3分钟,然后在室温下用PN缓冲液(PN:0.1M磷酸钠,0.1%nonidet?P40,pH?8),0.2x?SSC,0.1x?SCC和0.01x?SCC中洗涤1分钟。通过室温下以1000rpm离心3分钟而干燥载玻片。

        c)图像采集、特征提取和标准化

        通过扫描(Agilent?DNA微阵列扫描仪-Agilent?technologies,PaloAlto,USA)获得阵列的图像,并且用Imagene?5.6软件(Biodiscovery?Ltd,Marina?del?Rey,California)进行自动特征提取(两个通道Cy3和Cy5的每个斑点的信号和背景强度的斑点分段和定量)。使用了不良质量斑点的标记的默认设置。用microsoft?Excel表格从受试cDNA和参照cDNA的信号中值强度扣除局部背景。进行原始数据的强度的MA作图,以判断总体质量,并且排除不良质量实验。标准化是采用使用“loess”校正的TIGR?Midas或采用“Median”标准化进行的,并且在maNorm函数(marray?R?bioconductor软件包)中执行,具有相同结果。为了簇集的目的,也进行了阵列间标准化。由50的强度值代替低强度值。从进一步的分析中排除所有肿瘤中超过20%缺失值的基因。

        数据分析

        用软件TIGR?multi?experiment?viewer(TMev)进行未监督的簇分析。应用完全连锁和欧几里德距离。

        由于所有的杂交都是针对共同参照进行的,所有比较在不同组的结肠直肠赘生物之间都是相关的,认为与正常结肠直肠粘膜相比没有差异。用Wilcoxon秩检验和考虑亚群的新方法进行腺癌和腺瘤之间表达比较的有监督的分析。

        结果

        表1中提供了通过微阵列鉴定出在腺瘤和腺癌之间差异表达的基因。

        实施例2:表达数据的集成和CGH分析

        为了调查结肠直肠腺瘤向腺癌进展过程中染色体不稳定性对基因表达的影响,在一系列114个结肠直肠肿瘤(37个未进展的腺瘤,41个进展的腺瘤(恶性息肉)和36个癌)上通过阵列-CGH分析了全基因组拷贝数目改变。

        这里针对20q上的染色体获取区,详细描述了本发明公开的SROs的确定。对于41个进展的腺瘤,分析了腺瘤和腺癌成分的DNA拷贝数目改变。在>20%的病例中观察到了1p,4,8p,14q,15q,17p和18的缺失和1q,6p,7,8q,13q,17q,19p,20q和22q的获得,其中8p和18缺失以及13q和20q获得是最频繁的,发生在超过35%的病例中。单独的染色体20的获得发生在超过60%的病例中。在基因组范围,在进展的腺瘤中,拷贝数目改变的模式在腺瘤和腺癌成分之间没有差异,即,腺癌成分中发现的异常已经存在于腺瘤成分上,尽管频率或广度较低。

        随后,分析了37个未进展的腺瘤和36个癌的拷贝数目改变。在73个肿瘤中,67个(34个腺瘤和33个癌)显示了高质量的基因组概况(相应于8%退出)。在腺瘤中,异常的频率明显非常低。相反,腺癌显示了频繁的(>20%的病例)1p,4,8p,14q,15q,17p和18缺失,以及1q,6p,7,8q,13q,17q,19p,20q和22q获得,其中8p和18缺失以及13q和20q获得存在于35%以上的病例中(如同在进展的腺瘤中)。染色体20获得存在于少于15%的腺瘤中,但在超过60%的癌中,大多数影响整个染色体或长臂,如同在进展的腺瘤中。

        这67个肿瘤(未进展的腺瘤和癌)在DNA拷贝数概况上的等级簇集分析显示了癌和腺瘤明显区分为两个不同的簇,即分别是簇1和簇2,χ2检验p<0.001。在对未进展的腺瘤和腺癌之间有显著差异(p<0.05)的DNA拷贝数改变进行的检索中,我们观察到了4q,8p,8q,13q,15q,18和20是相关区域,其中20q上的基因座差异最显著(p<0.00001)。

        为了确定具有在结肠直肠癌进展中起作用的推定的癌基因的最相关区域,将STAC应用于石蜡包埋的恶性息肉(n=41)和冷冻的癌(n=33)的合并的集合。对于20q,这些样品的分析发现3个具有异??奖椿竦玫南喙厍?,一个跨4Mb(32-36Mb),一个跨3Mb(56-59Mb),第三个跨2Mb(61-64Mb)。这三个区域(最小重叠区-SROs)仍然分别含有80、35和94种基因。对于与腺癌相关的染色体异常的其他区域进行了相似的分析,对于这些区域的每一个,鉴定了SROs。

        在能获得快速冷冻材料的37个未进展的腺瘤和36个癌中进行了微阵列表达分析。在68个病例(37个腺瘤和31个腺癌,7%退出)中获得了高质量表达数据。

        阵列-CGH数据在基因组范围内与微阵列表达数据相关,不依赖于腺瘤或腺癌状况。为了比较具有某些染色体异常的肿瘤与缺乏所述异常的肿瘤之间的表达,为了公开表达受到染色体异常的影响的基因,开发了统计学算法(R环境)(de?Wiel,未发表的数据)。

        对于染色体异常的每个区域,获得了一系列基因,其基因剂量影响表达水平(表2-9)。鉴定了基因,其作图在染色体异常区内,并且显示了结肠直肠腺瘤和具有相关染色体异常的腺癌细胞之间的差异表达(表10-16)。

        下文对于20q上的染色体获得区更详细描述了这个过程。以两种不同的方式进行了目的在于鉴定20q上的推定癌基因的表达数据的有监督的分析。首先,研究了癌和腺瘤之间的基因差异表达(表1),其次,具有20q获得的肿瘤中的基因表达与没有20q获得的肿瘤比较(表8),以确定哪些基因中的表达水平受到20q获得的存在的影响。第一种方法发现了与腺瘤相比,在腺癌中的基因组范围的122种上调的基因和219种下调的基因(Wilcoxon检验p-值<1e-5或Thas评分>10.47)。在122种上调的基因中,14种作图在染色体20q上。对于第二种方法,仅仅使用了可以获得阵列-CGH数据和表达数据的肿瘤(腺瘤和腺癌)(n=64)。最为预选,使用在第一种方法中获得的在癌和腺瘤之间的表达值差异表达(上调和下调)的基因(截止p-值<0.05),以便集中于参与从腺瘤进展到癌的20q上的基因。采用这种分析,在基因组范围鉴定了127种基因,其表达水平是由于20q获得的存在。当我们比较两种方法之间共同的、作图在20q上的基因,即由于该染色体臂的获得而在癌中上调的基因时,发现了9种基因,即,TPX2,c20orf24,AURKA(STK6),RNPC1,TH1L,ADRM1,C20orf20,TCFL5和C20orf11。

        对于与结肠直肠腺癌相关的染色体缺失或获得的其他区域,进行了相似的分析。

        表1:在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因。(数据按p值排序)

        表2:具有8p上的染色体缺失的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序

        表3:具有8q上的染色体获得的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序。

        表4:具有13q上的染色体获得的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序。

        表5:具有15q上的染色体缺失的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序。

        表6:具有17p上的染色体缺失的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序。

        表7:具有18q上的染色体缺失的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序。

        表8:具有20q上的染色体获得的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(单变量分析)。数据按FDR值排序。

        表9:具有8q上的染色体获得的、在结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间差异表达的人基因(多变量分析)。

        表10:位于染色体缺失区内并且具有8p上的染色体缺失、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        ##:表10-16中的“命中数”是指独立测定的数目,在所述测定中对于给定基因观察到了改变的表达与结肠直肠腺癌细胞的存在之间的关联(与样品的基因组背景无关的改变的表达,即在染色体异常的类型上选择的样品集合的改变的表达)。

        表11:位于染色体缺失区内并且具有8q上的染色体获得、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        表12:位于染色体缺失区内并且具有13q上的染色体获得、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        表13:位于染色体缺失区内并且具有15q上的染色体缺失、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        表14:位于染色体缺失区内并且具有17p上的染色体缺失、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        表15:位于染色体缺失区内并且具有18q上的染色体缺失、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        表16:位于染色体缺失区内并且具有20q上的染色体获得、显示结肠直肠腺瘤和腺癌细胞之间的差异表达的人基因。

        表17:具有染色体异常、在结肠直肠腺瘤组织和结肠直肠腺癌组织之间具有改变的表达的标记基因。

        表18:在结肠直肠腺瘤细胞中的三种或更多种不同的染色体异常中具有改变的表达的标记基因。

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