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    重庆时时彩混合组选是什么一意思: 扶正化瘀五味子、虫草菌丝粉中间体指纹图谱质量检测方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN200910201482.6

    申请日:

    2009.12.18

    公开号:

    CN101708234A

    公开日:

    2010.05.19

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 30/36申请公布日:20100519|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/73申请日:20091218|||公开
    IPC分类号: A61K36/73; A61K9/20; A61K9/48; A61P1/16; G01N30/36; G01N30/86 主分类号: A61K36/73
    申请人: 上海现代中医药技术发展有限公司
    发明人: 胡坪; 潘一峰
    地址: 200051 上海市长宁区天山路600弄4号7F-C
    优先权:
    专利代理机构: 上海泰能知识产权代理事务所 31233 代理人: 黄志达;谢文凯
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200910201482.6

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.08.27|||2010.07.07|||2010.05.19

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法,包括:将制备的五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品分别于254nm和261nm下进行流动相的梯度洗脱;选取10批不同批次的扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体,根据上述两种检测方法进行高效液相色谱指纹图谱分析,每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱,确定了8个共有峰;将样品的HPLC指纹图谱分别与254nm和261nm下的标准指纹图谱进行比较,以8个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8。本发明的检测方法能全面控制扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的质量,以确保产品的质量稳定。

    权利要求书

    1: 一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法,包括: (一)检测方法A (1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备 称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体1.00克,置10mL容量瓶中,加50%甲醇5~8ml,超声处理20min,加50%甲醇至刻度,摇匀,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液; (2)梯度洗脱流动相 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,梯度洗脱条件为:流动相A相为0.05%磷酸-水,B相为乙腈;梯度洗脱:A相0-60-120min,95-60-10%、B相5-40-90%,流速0.8-1.2ml/min,检测波长254nm,柱温20-40℃,进样量10-20ul; (二)检测方法B (1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备 称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体0.50克,置10mL容量瓶中,加水5~8ml,超声处理20min,加水至刻度,摇匀,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液; (2)梯度洗脱流动相 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,梯度洗脱条件为:流动相A相为水,B相为乙腈;梯度洗脱:A相0-30min,100-93%、B相0-7%,流速0.8-1.2ml/min,检测波长261nm,柱温20-40℃,进样量10-20ul; (三)标准指纹图谱的建立 选取10批不同批次的扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体,根据上述两种检测方法进行高效液相色谱指纹图谱分析,每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱,对HPLC指纹图谱中所有峰进行比较,确定了8个共有峰,并按出峰时间先后次序进行编号; 其中,根据检测方法A于254nm波长下获取的指纹图谱a中,确定了4个共有峰(1~4号峰);根据检测方法B于261nm波长下获取的指纹图谱b中,确定了4个共有峰(5~8号峰); 确认共有峰中,2号峰五味子醇甲,3号峰为五味子醇乙,4号峰为五味子甲素,6号峰为尿苷,7号峰为鸟苷,8号峰为腺苷; (四)指纹图谱的质量控制 根据检测方法A于254nm波长下获取指纹图谱a,,将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱进行比较,以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8; 根据检测方法B于261nm波长下获取指纹图谱b,,将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱进行比较,以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8。

    说明书


    扶正化瘀五味子、虫草菌丝粉中间体指纹图谱质量检测方法

        【技术领域】

        本发明属五味子、发酵虫草菌粉中间体质量检测领域,特别是涉及一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法。

        背景技术

        扶正化瘀药物组合物是由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子六味药组成。目前上市有两种剂型:(1)扶正化瘀胶囊:2002年获得中国国家新药证书(国药证字Z20020053),并批准国家药品标准WS3-459(Z-79)-2005(Z);(2)扶正化瘀片:2005年获得国家新药证书(国药证字Z20050564),并批准国家药品标准YBZ19332005-2009Z。扶正化瘀具有舒肝活血、益精养肝、化瘀解毒、软坚散结、增强机体免疫功能等作用,主治慢性乙型肝炎肝纤维化、早期肝硬化。

        考虑到扶正化瘀制剂六味药材的有效成分性质差异较大,因此在生产过程中针对不同药味选用不同的提取方法。其中五味子和发酵虫草菌粉采用醇提工艺,具体如下:以约1g∶2g比例,取五味子和发酵虫草菌粉适量,用70%乙醇加热回流提取2次,第一次1.5h,第二次1h,合并提取液,浓缩至相对密度1.1-1.2(50℃-55℃),得醇提中间体。根据该提取工艺,醇提中间体中主要含五味子木质素成分,以及发酵虫草菌粉中的核苷类成分。

        近年来,指纹图谱技术已经成为中药复方质量控制与评价的重要手段,查阅国内外发表地文献,到目前为止没有扶正化瘀制剂醇提中间体指纹图谱分析的报道。因此本发明将弥补扶正化瘀制剂醇提中间体指纹图谱研究的空白。

        【发明内容】

        本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法,该方法能全面控制扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的质量,以确保产品的质量稳定。

        本发明的一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法,包括:

        (一)检测方法A

        (1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备

        称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体1.00克,置10mL容量瓶中,加50%甲醇5~8ml,超声处理20min,加50%甲醇至刻度,摇匀,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液;

        (2)梯度洗脱流动相

        用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,梯度洗脱条件为:

        ??时间(min)??A相:0.05%磷酸-水(%)??B相:乙腈(%)??0??95??5??60??60??40??120??10??90

        色谱柱C18柱,流动相A相为0.05%磷酸-水,B相为乙腈;梯度洗脱:A相0-60-120min,95-60-10%、B相5-40-90%,流速0.8-1.2ml/min,检测波长254nm,柱温20-40℃,进样量10-20ul;

        (二)检测方法B

        (1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备

        称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体0.50克,置10mL容量瓶中,加水5~8ml,超声处理20min,加水至刻度,摇匀,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液;

        (2)梯度洗脱流动相

        用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,梯度洗脱条件为:

        ??时间(min)??A相:水(%)??B相:乙腈(%)??0??100??0??30??93??7

        色谱柱C18柱,流动相A相为水,B相为乙腈;梯度洗脱:A相0-30min,100-93%、B相0-7%,流速0.8-1.2ml/min,检测波长261nm,柱温20-40℃,进样量10-20ul;

        (三)标准指纹图谱的建立

        选取10批不同批次的扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体,根据上述两种检测方法进行高效液相色谱指纹图谱分析,每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱,对HPLC指纹图谱中所有峰进行比较,确定了8个共有峰,并按出峰时间先后次序进行编号(图1);

        其中,根据检测方法A于254nm波长下获取的指纹图谱a中,确定了4个共有峰(1~4号峰);根据检测方法B于261nm波长下获取的指纹图谱b中,确定了4个共有峰(5~8号峰);

        经对照品定性鉴定,确认共有峰中,2号峰五味子醇甲,3号峰为五味子醇乙,4号峰为五味子甲素,6号峰为尿苷,7号峰为鸟苷,8号峰为腺苷;

        (四)指纹图谱的质量控制

        根据检测方法A于254nm波长下获取指纹图谱a,采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会),将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱(或共有模式指纹图谱)进行比较,以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8;

        根据检测方法B于261nm波长下获取指纹图谱b,采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会),将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱(或共有模式指纹图谱)进行比较,以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8。

        本发明采用两种样品前处理方法和色谱条件,建立了2张HPLC指纹图谱。其中指纹图谱1着重表达了扶正化瘀制剂醇提中间体中五味子木质素类成分的分布,指纹图谱2着重表达了扶正化瘀制剂醇提中间体中虫草核苷类成分的分布。通过色谱条件的优化,确定了色谱柱、流动相种类、流动相梯度、检测波长、柱温等色谱条件。

        有益效果

        1、用色谱的指纹特征,通过指纹图谱得到的量化参数,更有效地控制产品中间体的质量;

        2、考察了供试品溶液的稳定性,结果表明,在室温下,24小时之内,扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉提中间体供试品溶液保持稳定,精密度和重复性试验,都表明相似度在0.8以上;

        3、经过对10批扶正化瘀制剂五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的指纹图谱相似度进行计算,发现五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的相似度在0.8-1.0之间。说明建立的扶正化瘀制剂五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体指纹图谱质控方法,重复性好,专属性强,操作简便,方法可靠,可以对扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体质量进行科学、有效地评价,并且证实能够运用于实际生产中质量控制,满足企业对产品质量控制的需求。

        4、为扶正化瘀制剂进行指纹图谱质量控制提供了条件,同时也保证了扶正化瘀制剂的质量稳定。

        【附图说明】

        图1为扶正化瘀制剂五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体标准HPLC指纹图谱;

        其中,a为254nm,b为261nm;

        其中,2号峰五味子醇甲,3号峰为五味子醇乙,4号峰为五味子甲素,6号峰为尿苷,7号峰为鸟苷,8号峰为腺苷;

        图2为扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体样品HPLC指纹图谱图;

        其中,a为254nm,b为261nm。

        【具体实施方式】

        下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

        实施例1

        成品、试剂及仪器的准备:

        成品:扶正化瘀醇提中间体????来源:上?;坪V埔┯邢拊鹑喂?br>
        提取工艺:以约1g∶2g比例,取五味子和发酵虫草菌粉适量,用70%乙醇加热回流提取2次,第一次1.5h,第二次1h,合并提取液,浓缩至相对密度1.1-1.2(50℃-55℃),得醇提中间体。根据该提取工艺,醇提中间体中主要含五味子木质素成分,以及发酵虫草菌粉中的核苷类成分;

        试剂:甲醇(分析纯)??来源:上海振兴化工一厂;

        ??????磷酸(分析纯)??来源:上海联合化工厂;

        ??????乙腈(色谱纯)??来源:Tedia?company?Inc;

        ??????水为纯净水。

        标准品:五味子酯甲??来源:成都思科华生物技术有限公司;

        ????????五味子醇乙??来源:成都思科华生物技术有限公司;

        ????????五味子醇甲??来源:中国药品生物制品检定所;

        ????????腺苷????????来源:中国药品生物制品鉴定所;

        ????????尿苷????????来源:中国药品生物制品鉴定所;

        ????????鸟苷????????来源:新乡拓新生化科技有限公司。

        仪器

        (一)指纹图谱(254nm)的检测方法

        称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体1.00克,置10mL容量瓶中,加50%甲醇5~8ml,超声处理20min,加50%甲醇至刻度,摇匀,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液;

        色谱条件:

        柱温:30℃,检测波长:254nm,进样量:10μl,色谱柱:Alltima(250mm×4.6mm,5μm)。洗脱条件见表1,

        表1指纹图谱1的洗脱条件

        ??时间(min)??A相:0.05%磷酸-水(%)?B相:乙腈(%)??0??95??5??60??60??40??120??10??90

        (二)指纹图谱(261nm)的检测方法

        称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体0.50克,置10mL容量瓶中,加水5~8ml,超声处理20min,加水至刻度,摇匀,过0.45um微孔滤膜,取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液;

        色谱条件:

        柱温:30℃,检测波长:261nm,进样量:10μl,色谱柱:Alltima(250mm×4.6mm,5μm)。洗脱条件见表2,

        表2?指纹图谱2的洗脱条件

        ??时间(min)??A相:水(%)??B相:乙腈(%)??0??100??0??30??93??7

        在指纹图谱1测定条件确定后,通过对至少三批样品进行测定,计算相关参数,并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即五味子醇甲对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3%,保留时间重现性(RSD)不高于2%;色谱柱柱效以五味子醇甲计不少于15,000块理论塔板数。

        在指纹图谱测定条件2确定后,通过对至少三批样品进行测定,计算相关参数,并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即腺苷对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3%,保留时间重现性(RSD)不高于2%;色谱柱柱效以腺苷计不少于15,000块理论塔板数。

        扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体样品指纹图谱图见图2。

        对10个批次的扶正化瘀醇提中间体进行指纹图谱分析,每个中间体获得2张HPLC指纹图谱。采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(2004A版,中国药典委员会)分别对2种指纹图谱的相似度进行计算。采用共有峰模式,设定时间窗宽度为0.1min,以平均数法生成对照指纹图谱,分别将样品的2张HPLC指纹图谱与相应的标准指纹图谱进行比较,结果表明,10批扶正化瘀醇提中间体的2张指纹图谱与相应的标准指纹图谱的相似度均在0.8-1.0之间。说明建立的扶正化瘀醇提中间体指纹图谱质控方法,操作简便,方法可靠,证实能够运用于实际生产中质量控制,满足企业对产品质量控制的需求。

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