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    重庆时时彩下载官网: 血清SRAGE水平的检测试剂在筛选改善胰岛素Β细胞功能的糖尿病治疗药物中的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201310304169.1

    申请日:

    2013.07.18

    公开号:

    CN103376328A

    公开日:

    2013.10.30

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/68申请公布日:20131030|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20130718|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 上海交通大学医学院附属瑞金医院
    发明人: 宁光; 王柏凯; 顾卫琼; 洪洁; 张翼飞
    地址: 200025 上海市卢湾区瑞金二路197号
    优先权:
    专利代理机构: 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227 代理人: 韩国辉
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310304169.1

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.04.27|||2013.11.27|||2013.10.30

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了血清sRAGE水平的检测试剂在筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物中的应用。本发明通过在AHSCT和传统胰岛素注射两组治疗人群中所获取的血清sRAGE含量等参数指标,获得血清sRAGE水平与胰岛素β细胞功能的相关性,以期将血清sRAGE水平的检测试剂用于筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物。本研究表明sRAGE为糖尿病慢性并发症的?;ひ蛩?,可降低相关风险,sRAGE是一种新型的生物标志物,因此其检测试剂可以用于筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  血清sRAGE水平的检测试剂在筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物中的应用。

    说明书

    说明书血清sRAGE水平的检测试剂在筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物中的应用
    技术领域
    本发明涉及内分泌与代谢病学研究领域,具体涉及血清sRAGE水平的检测试剂在筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物中的应用。 
    背景技术
    晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts,AGEs)是机体其含氨基生物分子(主要为蛋白质,也包括核酸和脂类)在高糖环境下发生非酶性糖基化反应(Maillard反应)后所形成的结构复杂的化合物。一方面非酶糖化透过还原葡萄糖分子的游离醛或酮基与蛋白质游离氨基经亲核共价反应形成Schiff碱醛亚胺,Schiff碱醛亚胺经缓慢重排后形成稳定的Amadori产物(约4周),另一方面葡萄糖自身氧化或通过脂质糖基化可形成乙二醛和丙酮醛等中间产物,再经脱水、氧合和缩合等反应,形成不可逆的AGEs。AGEs因其复杂的重排及修饰过程拥有多种不同的化学结构,主要为N-羧甲基赖氨酸(carboxymethllysine,CML)和其他如葡萄糖源性AGE、甘油醛源性AGE等。 
    循环中AGEs及其它配体与晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)相互作用形成配体-RAGE轴,激活细胞内多条信号传导通路,在众多的疾病病理生理中都有参与,包括糖尿 病及其靶器官损害、动脉粥样硬化、免疫/炎症性疾病,神经退行性疾病等;RAGE由404个氨基酸组成,分为三部分:①344个氨基酸残基组成的胞外段,胞外域的主要功能是与特异的配体相结合,该区含有1个V区Ig样结构和两C区Ig样结构,该结构赋予了RAGE结合配体的活性,②19个氨基酸残基组成的疏水跨膜段,③43个氨基酸残基组成的胞内段,该区域较小,富含电荷,能够结合多种细胞内多种信号传导分支,为介导信号传导所必须;RAGE的内源性配体除了AGEs,还有S100/钙粒蛋白、高迁移率族蛋白1(high-mobility group box-1protein,HMGB1)、β折叠样蛋白(β-sheet fibrils)、β2-integrin Mac-1等。研究指出RAGE有四种剪接变异体:①全长的RAGE,②截去N端膜结合型(N端缺乏免疫球蛋白样区域V型区的变异体),③截去C端可溶型(缺乏C端部分序列的异形体),此型称为内源型分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE,esRAGE),可从细胞分泌到血液循环中;④裂解型RAGE(cleaved RAGE,cRAGE),全长的RAGE在细胞膜表面被金属蛋白酶(如ADAM-10、基质金属蛋白酶9)水解后的胞外部分也可进入到血液循环中。cRAGE和esRAGE皆属于可溶性RAGE(soluble form of RAGE),前者与后者的主要不同为cRAGE不由RAGE mRNA选择性剪接产生。 
    sRAGE因保留了胞外段但缺乏跨膜段及胞内段,故具有与全长型RAGE相同的配体结合能力但无激活信号传导能力,可透过竞争结合方式中和配体进而拮抗配体-RAGE轴介导的损伤,目前认为可做为一种反映体内病理变化的生物标记物;Basta G团队的研究显示血清sRAGE水平糖尿病患者显著低于非糖尿病人群,且与HbA1c、胰岛素抵抗指数、A100A12蛋白和C 反应蛋白存在负相关;降低的sRAGE水平和升高的S100A12增加心血管疾病的风险。有研究显示:健康个体中,血浆sRAGE水平与代谢综合征相关指标如BMI、腰臀比、空腹血糖、胰岛素抵抗呈负相关。Selvin E等研究提示低sRAGE水平群体相较高sRAGE水平群体,患糖尿?。℉R1.64,95%CI1.10to2.44)、冠状动脉疾?。℉R1.82,95%CI1.17to2.84)、全因死亡率(HR1.72,95%CI1.11to2.64)的风险提高。 
    目前对于动态血糖参数和sRAGE水平相关性研究较少。 
    发明内容
    本发明的目的在于针对血清sRAGE水平进行研究,获得血清sRAGE水平与胰岛素β细胞功能的相关性,以期将血清sRAGE水平的检测试剂用于筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物。 
    本发明拟采用动态血糖监测系统(CGMS)并测定血清sRAGE含量,通过在AHSCT和传统胰岛素注射两组治疗人群中所获取的日均血糖水平(MBG)、日内平均血糖波动幅度(MAGE)、日间血糖平均绝对差(MODD)及血清sRAGE含量等参数指标,来比较两种治疗方式对血糖波动和糖尿病并发症的相关性。 
    具体实施方式
    1.病例来源 
    收集2008年6月至2012年2月,至瑞金医院内分泌代谢科临床医学中心门诊或病房共收集符合入选标准(初发病程在6个月内,年龄14~30岁, 空腹C肽>0.4ng/ml,GAD>7.5u/ml)的初发T1D患者,将其分为常规胰岛素治疗组23例(对照组)和非清髓自体造血干细胞移植组27例(移植组),平均病程75.85±5313天,平均随访21.37±7.47月并详细询问家族史、既往史等情况。 
    2.实验方法 
    基本资料收集: 
    完善基本情况问卷及体格检查,包括:血压、身高、体重、腰围、臀围等。 
    采血完成空腹血样的检测,包括: 
    (1)OGTT+C肽释放试验:早晨7-9点之间受试者平静状态下休息5-10分钟,抽取空腹肘静脉血后,5分钟内喝下250ml左右葡萄糖水(含75g无水葡萄糖),从喝第一口水开始计时,分别在30分钟,1小时,2小时,3小时抽血; 
    (2)HbA1c; 
    (3)肝功能(ALT,AST,GGT); 
    肾功能(血肌酐,血尿酸); 
    血脂(TC、TG、HDL-C和LDL-C); 
    IAA,ICA,GADA。 
    3.建立sRAGE测定流程及方法 
    将采集的患者全血2小时内送至实验室,在常温下持续时间不超过两小时。 
    到达实验室后,经过离心(设定1500转,离心10分钟),将血液分为血清及血细胞部分,取上层的血清用去酶枪头分成200ul一份放至去酶EP管中。操作过程中操作员保证带好口罩和手套以免生物酶对血清的影响。分好的血清进行编号,暂存至-20℃的低温冰箱中保存备用。定期移至-80℃低温冰箱中保存。 


    检测方法 
    ELISA测定sRAGE在血清中表达情况。操作步骤如下: 
    ①预实验 
    所有试剂使用前均要放在室温,将标准人ULBP-2、MIC-1分别连续两倍稀释 
    为不同浓度,随机取患者、正常人血清样本连续两倍稀释为不同浓度。测定各自的吸光度,以此选取合适的血清稀释度。 
    ②备板 
    a.将包被抗体稀释至工作浓度。立即包被至96孔板中,每孔用100μl封板,在室温下放置过夜。 
    b.用吸球吸尽液体,然后用缓冲液清洗,并重复两次。每孔用缓冲液400μl冲洗。每一步中保证移去所有的液体有助于好的结果。最后一次移去缓冲液时,倒置板至干。 
    c.每孔加入300μl试剂稀释液(Reagent Diluent):室温下至少放置1h。 
    d.重复第二步洗板过程。 
    ③检测流程 
    a.添加溶解在试剂稀释液(Reagent Diluent)中的标准液或者血清,每孔各100μL。用密封条密封,并室温下保存2h。每板设置8个孔分别加入试剂稀释液或不同浓度的标准品用于制作标准曲线,同时设置两个底物孔、两个蒸馏水孔作为对照孔。每个样本各设置两个副孔以减少误差。 
    b.按备板第二步再次洗板。 
    c.每孔加入检测抗体(在试剂稀释液中稀释好的),然后用新的胶条封板,在室温下放置2h。检测抗体稀释过程同包被抗体(见备板第一步)。 
    d.按备板第二步再次洗板。 
    e.加入100μl工作浓度的streptavidin-HRP,在避光条件下室温中放置20分钟。 
    f.按备板第二步再次洗板。 
    g.每孔加入底物溶液100μL,室温中避光放置20分钟。 
    h.每孔加入50μl停止液,轻拍板以保证充分混合。 
    i.立即用酶标仪检测每孔的吸光度。设定的波段为450nm、570nm,将450nm处数值减去570nm处的数值,以消除板中存在不可剔除的光学误差。 
    4.统计学分析 
    所有统计分析在SPSS19软件完成。计量资料描述应用均数±标准差(`X±SD)表示。使用计量资料统计描述、运用Kolmogorov-Smirnov、回归分析等对相关数据进行统计学分析。p<0.05为差异有统计学意义。 
    进行组间比较时,组间均数比较采用独立样本t检验,百分率资料采用非参数检验,均做双侧性检验,p<0.05为差异有统计学意义。 
    结果 
    基线sRAGE水平在移植组中表达最高为970.90pg/ml,最小为100.28pg/ml,平均为393.31±219.26pg/ml。sRAGE在对照组中表达最高为969.05pg/ml,最小为141.00pg/ml,平均为514.32±227.96pg/ml,两组无明 显统计学意义,具有可比性。随访24个月后血清sRAGE水平在移植组中呈上升趋势,平均由393.31pg/ml上升至587.92pg/ml,而在对照组则相反,呈下降趋势,平均由514.32pg/ml下降至406.89pg/ml。 
    表1血清sRAGE浓度 
    随访时间 观察值 移植组 对照组 P Value 基线 sRAGE(pg/ml) 393.31±219.26 514.32±227.96 0.089 治疗后 sRAGE(pg/ml) 587.91±284.09 406.89±158.49 0.013
    50例次有效观察对象的sRAGE与各项代谢指标行Pearson相关分析,结果表明血清sRAGE水平与Cmax、AUCC呈显著正相关(r分别为0.292、0.216,皆P<0.05);另外,sRAGE水平与CP0h、CP1h、CP2h、单位胰岛素用量呈显著相关(r分别为0.341、0.219、0.291、-0.210,P皆<0.05),与肝功能、血脂、糖化血红蛋白无显著相关。 
    表2sRAGE与胰岛β功能的相关性 
    观察值 CP0h Cmax AUCC HbA1c sRAGE(pg/ml) r=0.341** r=0.292** r=0.216* r=-0.164
    **P<0.01,*P<0.05 
    讨论: 
    研究显示sRAGE水平与胰岛β细胞功能呈显著正相关。鉴于“配体-RAGE轴”在糖尿病大小血管病变中扮演的重要角色,是糖尿病患者致残、致死的主要原因,而sRAGE因其可阻断“配体-RAGE轴”所介导的信号传导途径,具有减轻氧化应激反应,达到改善糖尿病慢性并发症预后的特性。 
    研究表明sRAGE为糖尿病慢性并发症的?;ひ蛩?,可降低相关风险,sRAGE是一种新型的生物标志物,因此其检测试剂可以用于筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物。 
    以上所述为本发明的较佳实施例而已,但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改,都落入本发明?;さ姆段?。 

    关 键 词:
    血清 SRAGE 水平 检测 试剂 筛选 改善 胰岛素 细胞 功能 糖尿病 治疗 药物 中的 应用
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