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    春节重庆时时彩开吗: 一种双组份植物激素的同时测定方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201310253926.7

    申请日:

    2013.06.25

    公开号:

    CN103323607A

    公开日:

    2013.09.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):G01N 33/74变更事项:专利权人变更前:青岛科技大学变更后:青岛科技大学变更事项:地址变更前:266000 山东省青岛市平度市明村镇前楼村变更后:266000 山东省青岛市崂山区松岭路99号|||专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):G01N 33/74变更事项:专利权人变更前:青岛科技大学变更后:青岛科技大学变更事项:地址变更前:266000 山东省青岛市崂山区松岭路69号变更后:266000 山东省青岛市平度市明村镇前楼村|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/74申请日:20130625|||公开
    IPC分类号: G01N33/74; G01N33/531; G01N21/76 主分类号: G01N33/74
    申请人: 青岛科技大学
    发明人: 混旭; 陈坏成
    地址: 266000 山东省青岛市崂山区松岭路69号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310253926.7

    授权公告号:

    ||||||103323607B||||||

    法律状态公告日:

    2018.08.07|||2017.12.22|||2015.02.25|||2013.10.30|||2013.09.25

    法律状态类型:

    专利权人的姓名或者名称、地址的变更|||专利权人的姓名或者名称、地址的变更|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种双组份植物激素的同时测定方法,用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体,以[email protected]为纳米粒子标记物,实现对两种植物激素的捕获,并以抗体标记的[email protected]纳米粒子为化学发光探针,再用磁性分离和离心方法实现所捕获激素的分离,然后测定磁性分离液和离心分离液的化学发光信号,从而实现了两种植物激素的检测。本发明仅需磁珠、纳米粒子和简单的化学发光技术就实现了植物激素IAA与GA的同时测定,方法简单、成本低、灵敏度高的优势。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种双组份植物激素同时测定的方法,植物激素为IAA和GA的双组份,其特征在于用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体,以[email protected]为纳米粒子标记物,实现植物激素IAA和GA的双组份同时测定,测定步骤如下:
    (1)金纳米粒子AuNPs的制备,制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水泡洗30 min,然后用二次蒸馏水冲洗干净,烘干备用;在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL质量浓度0.01%的HAuCl4,搅拌加热至沸腾,然后快速加入1.8 mL质量浓度1%的Na3C6H5O7,继续加热10 min,搅15 min,冷却至室温,转移到棕色瓶中于阴凉处保存;
    (2)anti?IAA抗体标记金纳米粒子的制备,取2 mL的样品管,依次加入pH为8.2的2 μL 500 mM的Tris?HCl,6 μL10 mM的TCEP,6 μL 10?4 M的巯基乙胺,室温放置30 min后加入1 mL 步骤(1)制备的AuNPs,室温下反应12 h,得巯基乙胺修饰金纳米粒子;取上述所得的巯基乙胺修饰金纳米粒子分散在含5(wt)%戊二醛的磷酸缓冲溶液中,持续搅拌2 h,用磷酸缓冲溶液离心清洗3次,再将其在磷酸缓冲溶液中,加入含10 μg anti?IAA抗体溶液,4 ℃振动孵育12 h,得到anti?IAA抗体标记金纳米粒子;
    (3)anti?GA抗体标记磁珠的制备,在2 mL的样品管中加入含10 μg anti?GA抗体溶液,再加入1000 μL 含0.1 M的EDC和0.2 M的NHS,活化30 min,另取一个10 mL的小烧杯,加入50 μL粒径为2~3 μm氨基化磁珠,2000 μL 0.1M,pH为6.8咪唑缓冲液,活化30 min;将上述两溶液混合反应12 h,磁性分离,弃上清液,再用磷酸缓冲溶液洗三次,用磷酸缓冲溶液定容至500 μL,得到anti?GA抗体标记磁珠;
    (4)抗体标记[email protected]的制备
    a. [email protected]纳米粒子的制备,将5 mL经过恒温的HAuCl4溶液加入到5 mL浓度为 50 mg/mL的BSA溶液中,搅拌反应2 min,然后加入0.5 mL 1 M NaOH,并在37 ℃下继续反应1小时,得[email protected]纳米粒子,粒径为2?3 nm,室温下保存;
    b. [email protected]的制备,在pH为7.4的PBS缓冲溶液加入1 mL [email protected],再加入NHS 10 mg、EDC 20mg,将该混合液在37 ℃下搅拌1小时,然后加入1 mL N?(4?氨丁基)?N?乙基异鲁米诺溶液,在室温下搅拌12?18小时,得到[email protected]复合物;
    c. 抗体标记[email protected]的制备,取1 mL [email protected]溶液,加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg,在37 ℃下活化1小时,再加入100 μL的[email protected],反应时间12?18小时;再将其分成两份,一份加入含10 μg anti?IAA抗体溶液,4 ℃振动孵育1 h,得到IAA抗体标记[email protected];另外一份10 μg anti?GA抗体溶液,4 ℃振动孵育12 h,得到GA抗体标记[email protected];
    (5)双组分植物激素的检测,将不同量的目标物IAA和GA标准溶液分别混合,加入anti?GA抗体标记磁珠和anti?IAA抗体标记金纳米粒子,37 ℃孵育1 h,离心分离,离心机转速为14000 rpm,分离后用PBST溶液清洗3次,再加入GA抗体标记[email protected]和IAA抗体标记[email protected]混合溶液,37 ℃孵育1 h;随后,用包含有2% BSA的WB洗涤液洗涤3次,分成2等份,一份在磁性分离器下吸弃上清液,下层溶液用磷酸缓冲溶液洗涤3次,然后进行化学发光测定,根据化学发光信号对GA进行定量;另外一份,在磁性分离器下吸取上清液,将所得上清液在13000 rpm转速下离心,收集沉淀,并用磷酸缓冲溶液洗涤3次,然后进行化学发光测定,根据化学发光信号对IAA进行定量,根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线;
    (6)样品分析,将微纳米级微透析探针插入模式植物内部,对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样,在通道下游待测组分按步骤(5)方法进行实验,根据化学发光信号和步骤(5)所得标准曲线可以获取植物激素IAA和GA含量。

    2.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述化学试剂为分析纯试剂,所有溶液均用二次蒸馏水配置。

    3.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述磷酸缓冲液为0.2M,pH=7.4,的配制方法:称取0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4·12H2O溶解于1L水中。

    4.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述PBS缓冲溶液是0.2 M,pH=7.4,其的配制方法是称取0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl、2.9 g Na2HPO4·12H2O及0.2 g KCl溶解于1L水中。

    5.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述PBST溶液的配制方法是在浓度为0.2M,pH=7.4的1 L PBS缓冲溶液中加入1 mL的吐温?20。

    6.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述WB洗涤液配制方法是称取2.429g三(羟甲基)氨基甲烷,9.959 g氯化钠,0.509 g吐温?20,用 500 mL超纯水溶解后,用0.1 M盐酸调PH至8.0,最后用超纯水稀释至 1000 mL。

    7.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述化学发光测定选用MPI?E型化学发光分析系统。

    8.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述振荡孵育选用THZ?82A气浴恒温振荡器。

    9.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述离心机选用Anke?TGL?16C飞翁牌高速离心机。

    10.   根据权利要求1的双组份植物激素同时测定的方法,其特征在于所述pH测量选用PHS?3D型酸度计。

    说明书

    说明书一种双组份植物激素的同时测定方法
    技术领域
    本发明属于化学发光技术领域,涉及一种双组份植物激素同时测定的方法,具体涉及植物激素吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)双组份的同时测定方法。 
    背景技术
    植物激素是一些对植物生命攸关的化学信号分子,在植物体内合成,并以极微量的浓度引发生理效应,影响和控制着植物的生长发育及其对环境的适应性。植物激素在植物体内的含量很低。近年来植物激素测定方法主要有:液相色谱?质谱法(卢巧梅, 张兰, 陈天文, 卢明华, 陈国南. 液相色谱?串联质谱分析盐胁迫下植物激素的含量变化. 中国科学 B 辑:化学 2009, 39: 785);气相色谱?质谱法(Barkawi L S, Tam Y Y, Tillman J A, Pederson B, Calio J, Al?Amier H, Emerick M, Normanly J, Cohen J D. A high?throughput method for the quantitative analysis of indole?3?acetic acid and other auxins from plant tissue. Anal Biochem, 2008, 372: 177);免疫传感器法(Xiao L. T, Wang R Z. Immunosensor assay: a novel method to analyze phytohormones. PGRSA Quarterly. 2006, 33:51)和化学发光法(Hun X, Mei Z H, Wang Z P, He Y H. Indole?3?acetic acid biosensor based on G?rich DNA labeled AuNPs as chemiluminescence probe coupling the DNA signal amplification. Spectrochimica Acta Part A, 2012, 95:114)等。 
    但是,这些方法的各有其缺点,本发明利用金纳米粒子和磁珠为载体,以 [email protected]为纳米粒子标记物,实现了植物激素吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的双组份测定,具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。 
    发明内容
    本发明目的是提供一种同时测定双组份植物激素的方法,利用金纳米粒子和磁珠为载体,以[email protected]为纳米粒子标记物,实现植物激素吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的双组份同时测定。 
    技术方案
    一种双组份植物激素同时测定的方法,植物激素为吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的双组份,其特征在于用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体,以[email protected]为纳米粒子标记物,实现植物激素吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的双组份同时测定,测定步骤如下:
    (1)金纳米粒子(AuNPs)的制备,制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器(容量瓶,棕色广口瓶,圆底烧瓶等)用王水(盐酸硝酸比例为1:3)泡洗30 min(分钟),然后用二次蒸馏水冲洗干净,烘干备用;在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL质量浓度0.01%的氯金酸(HAuCl4),搅拌加热至沸腾,然后快速加入1.8 mL质量浓度1%的柠檬酸三钠(Na3C6H5O7),继续加热10 min,搅15 min,冷却至室温。转移到棕色瓶中于阴凉处保存;
    (2)anti?IAA抗体标记金纳米粒子(AuNPs)的制备,取2 mL的样品管,依次加入2 μL 500 mM(毫摩尔/升)的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris?HCl)(pH为8.2),6 μL 10 mM的磷酸三氯乙酯(TCEP),6 μL 10?4 M的巯基乙胺,室温放置30 min后加入1 mL 步骤(1)制备的AuNPs,室温下反应12 h(小时),得到巯基乙胺修饰金纳米粒子;取上述所得的巯基乙胺修饰金纳米粒子分散在含5(wt)%戊二醛的磷酸缓冲溶液中,持续搅拌2 h,用磷酸缓冲溶液离心清洗3次,再将其在磷酸缓冲溶液中,加入含10 μg anti?IAA抗体溶液,4 ℃振动孵育12 h,得到anti?IAA抗体标记金纳米粒子;
    (3)anti?GA抗体标记磁珠的制备,在2 mL的样品管中加入含10 μg anti?GA抗体溶液,再加入1000 μL 含0.1 M的1?乙基?3(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.2 M的N?羟基琥珀酰亚胺(NHS),活化30 min,另取一个10 mL的小烧杯,加入50 μL氨基化磁珠(2~3 μm),2000 μL咪唑缓冲液(0.1 M,pH为6.8),活化30 min;将上述两溶液混合反应12 h,磁性分离,弃上清液,再用磷酸缓冲溶液洗三次,用磷酸缓冲溶液定容至500 μL,得到anti?GA抗体标记磁珠;
    (4)抗体标记[email protected]的制备
    a. [email protected]纳米粒子的制备,将5 mL经过恒温的HAuCl4溶液加入到5 mL浓度50 mg/mL 牛血清白蛋白(BSA)溶液中,搅拌反应2 min,然后加入0.5 mL 1M NaOH,并在37 ℃下继续反应1 h,得到[email protected]纳米粒子,粒径为2?3 nm,室温下保存;
    b. [email protected]的制备,在PBS缓冲溶液加入1 mL [email protected],再加入10 mg NHS、20 mg EDC,将该混合液在37℃下搅拌1 h,然后加入1 mL N?(4?氨丁基)?N?乙基异鲁米诺(ABEI)溶液,在室温下搅拌12?18 h,得到[email protected]复合物;
    c. 抗体标记[email protected]的制备,取1 mL [email protected]溶液,加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg,在37 ℃下活化1 h,再加入100 μL的[email protected],反应时间12?18 h;再将其分成两份,一份加入含10 μg anti?IAA抗体溶液,4 ℃振动孵育12 h,即得IAA抗体标记[email protected];另外一份10 μg anti?GA抗体溶液,4 ℃振动孵育12 h,得到GA抗体标记[email protected];
    (5)双组分植物激素的检测,将不同量的目标物IAA和GA标准溶液分别混合,加入anti?GA抗体标记磁珠和anti?IAA抗体标记金纳米粒子,37 ℃孵育1 h,离心分离(离心机转速为14000 rpm)后用PBST溶液清洗3次,再加入GA抗体标记[email protected]和IAA抗体标记[email protected]混合溶液,37℃孵育1 h;随后,用包含有2% BSA的WB洗涤液洗涤3次,分成2等份,一份在磁性分离器下吸弃上清液,下层溶液用磷酸缓冲溶液洗涤3次,然后进行化学发光测定,根据化学发光信号对GA进行定量;另外一份,在磁性分离器下吸取上清液,将所得上清液在13000 rpm转速下离心,收集沉淀,并用磷酸缓冲溶液洗涤3次,然后进行化学发光测定,根据化学发光信号对IAA进行定量,根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线;
    (6)样品分析,将微纳米级微透析探针插入模式植物内部,对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样,在通道下游待测组分按步骤(5)方法进行实验,根据化学发光信号和步骤(5)所得标准曲线可以获取植物激素IAA和GA含量。
    本发明的化学试剂优选分析纯试剂,所有溶液均用二次蒸馏水配置。 
    本发明的磷酸缓冲溶液为0.2 M(pH7.4),的配制方法:称取0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4·12H2O溶解于1 L水中。 
    本发明的PBS缓冲溶液为0.2 M(pH7.4),的配制方法:称取0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl、2.9 g Na2HPO4·12H2O及0.2 g KCl溶解于1 L水中。 
    本发明的PBST溶液的配制:在0.2 M(pH7.4)的1 L PBS缓冲溶液中加入1 mL的吐温?20,吐温?20的体积浓度为0.1%。 
    本发明的WB洗涤液:称取2.429 g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris),9.959 g氯化钠,0.509 g吐温?20,用 500 mL超纯水溶解后,用0.1 M盐酸调PH至8.0,最后用超纯水稀释至 1000 mL即得。 
    本发明的化学发光测定选用MPI?E型化学发光分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司)。 
    本发明的振荡孵育选用THZ?82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)。 
    本发明的离心机选用Anke?TGL?16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)。 
    本发明的pH测量选用PHS?3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)。 
    本发明的显著效果
    本发明研究了不同浓度IAA和GA与发光强度之间的关系,得到了检测IAA和GA的标准曲线,线性范围及线性方程。
    当IAA的浓度在0.02 ng/mL?20 ng/mL之间时,随着IAA浓度的变化,化学发光强度有明显变化。经计算得到检测IAA的非线性方程为ICL = ?647.65*exp(?x/0.61) ? 5857.63*exp(?x/7.16) + 6466.90(ICL 是体系的化学发光强度;x是IAA的浓度,ng/mL;n = 12,n表示同一浓度测定次数,R2 = 0.9997)。IAA的浓度在0.02 ng/mL?0.3 ng/mL范围内与化学发光强度呈一定的线性关系,其线性回归方程是ICL = 1273.1x ? 2.44,线性相关系数R= 0.9991,检测限是0.01 ng/mL(3σ)。 
    当GA的浓度在0.02 ng/mL?20 ng/mL之间时,随着GA浓度的变化,化学发光强度有明显变化。经计算得到检测GA的非线性方程为ICL =?6049.94*exp(?x/20.42) ?3765.90*exp(?x/3.18) + 9815.16(ICL 是体系的化学发光强度;x是GA的浓度,ng/mL;n = 12,R2 = 0.9989)。GA的浓度在0.02 ng/mL?0.3 ng/mL范围内与化学发光强度呈一定的线性关系,其线性回归方程是ICL = 1308.9x + 6.322,线性相关系数R= 0.9995,检测限是0.008 ng/mL(3σ)。 
    该测定方法的精密度通过对浓度为0.3 ng/mL的IAA和GA进行11次平行测定而计算得出,相对标准偏差分别为3.7%和3.9%,表明本发明的测定方法有较好的重现性。 
    附图说明
    图1. [email protected]纳米粒子标记物双组份植物激素的同时测定原理图 
    图2. IAA(A)和GA(B)标准曲线,其中A是IAA的标准曲线,横坐标是IAA浓度,单位是ng/mL,纵坐标ICL是体系的化学发光强度;B是GA的标准曲线,横坐标是GA浓度,单位是ng/mL,纵坐标ICL是体系的化学发光强度。
    具体实施方式
    按照技术方案的步骤(1)至(5)得到IAA(A)和GA(B)标准曲线见图2,其中巯基乙胺、N?(4?氨丁基)?N?乙基异鲁米诺(ABEI)均购自上海阿拉丁试剂;牛血清白蛋白(BSA)、N?羟基琥珀酰亚胺(NHS),1?乙基?3(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)购自Acros(New Jersey, USA),三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris?HCl),国药集团化学试剂有限公司;氯金酸(HAuCl4),柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)均购于天津市博迪化工有限公司;氨基化磁珠购自天津倍思乐色谱技术开发中心。 
    根据发明的方法对IAA和GA含量进行了测定,并采用标准加入法对方法进行了评价,样品测定回收率为96.0–102.2%,测定结果见表1,本发明的方法在IAA和GA检测中具有精密度高的特点。测定时用微纳米级微透析探针插入模式植物玉米颈部,对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样。 
    表1. 样品分析测定结果 

    a7次测量结果
    b 单位:ng/mL。

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    一种 双组份 植物 激素 同时 测定 方法
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