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    忆君重庆时时彩卡密: 一种黑鲍菇液体菌种制备及高产栽培的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201310267660.1

    申请日:

    2013.07.01

    公开号:

    CN103404366A

    公开日:

    2013.11.27

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A01G 1/04申请公布日:20131127|||实质审查的生效IPC(主分类):A01G 1/04申请日:20130701|||公开
    IPC分类号: A01G1/04 主分类号: A01G1/04
    申请人: 鲁东大学
    发明人: 蔡德华
    地址: 264025 山东省烟台市红旗中路186号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310267660.1

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.01.11|||2015.03.18|||2013.11.27

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种黑鲍菇液体菌种制备及高产栽培的方法,属于食用菌栽培学领域。黑鲍菇在生物学分类中属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。其总糖含量高达44.4%,并含有各种维生素和人体必需的氨基酸及微量元素,经常食用能降低血压和胆固醇,预防动脉硬化等。目前关于液体菌种生产的研究主要集中在金针菇、羊肚菌等人工栽培较困难或产量较低的食用菌的配方筛选、菌种筛选、规?;畈惴⒔凸ひ盏?。为了充分发挥液体菌种在黑鲍菇生产中的优势,本课题对液体培养黑鲍菇种进行了比较系统的研究。我们在栽培方式和管理措施上加以改进和创新,经过几年探索和反复试验终于研究出了液体摇瓶培养和发酵罐培养黑鲍菇菌种的生产应用的新途径。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  在一种黑鲍菇液体菌种制备的方法,其特征在于确定了黑鲍菇液体种的最适宜培养基为玉米粉5~6%,红糖1%,麦麸0.05%,蛋白胨0.05%(或酵母粉0.5%),KH2PO40.05%,MgSO40.05%,VB110mg/L,PH值6.0~7.0。

    2.  如权利要求1所述的一种黑鲍菇液体菌种制备的方法,其特征在于确定了黑鲍菇液体种最适宜的培养条件:最佳PH为6.0~7.0,最佳的装液量为180~200ml,接种后先静止培养48h再在摇床转速为170~180r/min,培养温度为25~26℃下震荡培养4~5d最佳。

    3.  如权利要求1所述的一种黑鲍菇液体菌种制备的方法,其特征在于确定了黑鲍菇液体种在室温(26~30℃)下存放1d生物学效率最高,存放15d以内产出鲜菇高于固体种,
    在冰箱内5℃下保存3个月也不至于影响鲜菇产量。

    4.  一种黑鲍菇栽培的方法,其特征在于选出适合黑鲍菇栽培的原料最佳三种配方:①棉籽壳90%,麦麸(米糠)10%,生石灰2%(外加),含水量调至60~65%,pH值自然   ②玉米芯30%,棉籽壳50%,果汁渣20%,生石灰5%(外加),含水量调至60~65%,pH值6.5~7.0    ③棉籽壳(或玉米芯)58%,木屑40%,蔗糖1%,石膏粉1%,生石灰1%(外加),含水量60~65% ,pH值自然。

    说明书

    说明书一种黑鲍菇液体菌种制备及高产栽培的方法
    技术领域
    一种黑鲍菇液体菌种制备及高产栽培的方法,属于食用菌栽培学领域。 
    背景技术
    在黑鲍菇[Pleurotus ostreatus(Jacg.exFr.)],又称黑平菇、灰平菇、北风菌、元菇、边脚菇、鲍鱼菇等,在生物学分类中属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。其子实体菌盖呈贝壳形或扇形等,菌盖表面灰黑光亮,肉肥质嫩、味道鲜美、营养丰富。其总糖含量高达44.4%,并含有各种维生素和人体必需的氨基酸及微量元素,经常食用能降低血压和胆固醇,预防动脉硬化,治疗植物性神经紊乱等,被国内外称为功能食品、保健食品。因其子实体有浓鲜的鲍鱼味,故称之“鲍鱼菇”。目前关于液体菌种生产的研究主要集中在金针菇、竹荪、羊肚菌等人工栽培较困难或产量较低的食用菌的配方筛选、菌种筛选、规?;畈惴⒔凸ひ盏?,并只取得了一定的进展,而对比较适合目前菌种厂生产规模的液体摇瓶培养菌种的生理及应用技术的研究报道很少。为了充分发挥液体菌种在黑鲍菇生产中的优势,本课题对液体培养黑鲍菇种进行了比较系统的研究。另外,我们在栽培方式和管理措施上加以改进和创新,经过几年探索和反复试验终于研究出了液体摇瓶培养和发酵罐培养黑鲍菇菌种的生产应用的新途径。 
    发明内容
    (一)液体种营养物质和培养基筛选的研究 
    1材料 
    11供试菌种黑鲍菇PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.2基础培养基蔗糖1%,蛋白胨0.5%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%,VB110mg/L。 
    1.3摇瓶培养基可溶性淀粉5%、蔗糖1%、MgSO40.15%、KH2PO40.3%、酵母膏(粉)0.1%,pH值自然。 
    2方法 
    2.1一级摇瓶种的制备将刚培养好的试管斜面菌种在无菌的条件下挑取黄豆粒大小4-6块接入500ml(装液量200ml)三角烧瓶中,让菌丝面朝上漂浮于液面上,置于25℃恒温箱中静止培养48h,然后于25℃,180r/min旋转式摇床震荡培养5~6d. 
    2.2二级摇瓶种的制备在500ml(装液量200ml)三角烧瓶中接入一级摇瓶种,接种量为 10%,置于25℃、180r/min旋转式摇床振荡培养5d,种液澄清、淡黄,取出种瓶静放,分布均匀,终止发酵。然后测其生物量、菌球密度和菌球直径,进行方差分析。 
    2.3生物量测定发酵终止后,将二级摇瓶中的培养液用15×15cm3~4层纱布过滤,再用水冲洗几次后,于60℃烘干箱烘干至恒重,测其生物量。 
    2.4菌球密度的测定将菌液置于200ml量筒中静止5min,测菌球占菌液体积的百分比。 
    2.5菌球直径的测定随机取菌球排成一条5cm直线,数出5cm直线内的菌球数,然后用菌球数除以5cm,即得菌球的平均直径。 
    2.6最适碳源的筛选实验将基础培养基中的碳源分别用1%的蔗糖、葡萄糖、红糖、麦芽糖、果糖、白糖作为碳源,以无碳源基础培养基作为对照组,各碳源重复3次,培养条件同摇瓶种。发酵终止,测定各种碳源对其生物量的影响。 
    2.7最适氮源的筛选实验将基础培养基中的氮源分别用0.1%的酵母膏(粉)、蛋白胨、牛肉膏、NH4CL、NaNO3、(NH4)2CO3作为氮源,以无氮源基础培养基为对照,各重复3次,培养条件同摇瓶种,发酵终止,测定各种氮源对其生物量的影响。 
    2.8最适无机盐的筛选实验将基础培养基中的无机盐,分别用0.2%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、CaCO3作为无机盐,以无机盐基础培养基为对照,各重复3次,培养条件同上,发酵终止,测定各种无机盐对其生物量的影响。 
    2.9农副产品水解液制作黑鲍菇液体培养基的筛选实验为了降低成本,我们在筛选黑鲍菇液体种最佳配方后,又研究了玉米粉、麦麸、豆粉、花生饼粉、米糠等农副产品作为碳源和氮源的试验,并各加1%的红塘,设定了四种培养基配方。配方A:玉米粉5%,红糖1%,麦麸3~5%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%,PH值6~7。配方B:玉米粉6%,红糖1%,豆粉2%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%,PH值6.0~7.0。配方C:玉米粉5%,红糖0.5%,花生饼粉2%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%,VB110mg,PH值6.0~7.0。配方D:玉米粉5%,红糖0.5%,米糠4%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%,PH值6.0~7.0。对照组:可溶性淀粉5%,蔗糖1%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,酵母膏(粉)0.1%。每组设8个重复,震荡培养5d,检测黑鲍菇菌丝生长情况。 
    3.结果与分析 
    3.1最适碳源的筛选结果经方差分析表明,各组间的菌丝体平均干重差异有显著性意义(P<0.05=。说明不同碳源对黑鲍菇菌丝体生长有明显的差异。 
    表1最适碳源的筛选结果 

    从表1可以看出,黑鲍菇菌丝体对碳源的利用比较广泛,单糖、双糖均适应,但在单糖中,以葡萄糖为宜,在双糖中,蔗糖为宜。在本实验中,蔗糖是最理想的碳源,在同样的培养条件下,菌球数量最多,生物量最高。果糖利用的最差。故本实验选用蔗糖为最佳碳源培养摇瓶种,其次为葡萄糖。 
    3.2最适氮源的筛选结果经方差分析表明,各组菌丝体生物量的差异性显著(p<0.05),说明不同氮源对黑鲍菇菌丝体生物量的影响存在着明显的差异。 
    表2不同氮源对黑鲍菇菌丝体生长的影响 

    从表2可以看出,菌丝体对有机氮的利用优于无机氮,这也符合大多食用菌的要求。其中以酵母膏(粉)为最好的有机氮,其次为蛋白胨和牛肉膏。黑鲍菇在无机氮的利用中硝态氮略强于氨态氮。 
    3.3最适无机盐的筛选试验经方差分析,各组菌丝体生物的差异性显著(P< 0.05)。在该实验中,适宜黑鲍菇菌丝体生长的无机盐依为 
    MgSO4>KH2PO4>K2HPO4>ZnSO4>CaCO3>FeSO4。 
    表3不同无机盐对黑鲍菇菌丝体生长的影响 

    从表3可以看出,以MgSO4和KH2PO4为最佳,其次是K2HPO4??杉鸐g、P、K对黑鲍菇菌丝体的生长有较大的影响。 
    3.4农副产品水解液培养基的筛选结果 
    从表4可以看出,用农副产品水解液配方与用试剂配方相比,菌球大小、菌球活力均无明显差别,配方A和配方B的菌丝体干重平均值都高于对照组,t检验表明,与对照组相比,配方A、B平均菌丝体干重的差异有显著性意义。因此选用配方A制作液体培养基不仅成本低,而且效果好。 
    表4农副产品水解液培养基培养黑鲍菇菌丝体的生长情况 

    3.5正交试验筛选最佳培养基选用三种适合液体培养黑鲍菇菌丝生长的碳源和氮源,设计 4个因素,3个水平的正交试验,9个组合,5个重复,筛选出适宜的单一碳源和单一氮源及各自的含量,结果见表5,表6。 
    表5L9(34)正交试验设计 

    表6各组分L9(34)正交试验设计 

    从表6分析看出,以菌丝干重为参考指标,最佳组合为A1B3C3D3,即红糖1%,玉米粉5%,麦麸5%,蛋白胨0.5%。用最佳组合加微量元素,即KH2PO40.05%,MgSO40.05%,VB110mg/L,配合后即成为黑鲍菇最佳液体培养基。 
    (二)理化因子对黑鲍菇液体培养菌丝生长影响的研究 
    近年来,我省黑鲍菇生产发展非???,但目前使用的黑鲍菇菌种多为固体方式制作,周期较 长,耗能较多。与黑鲍菇固体菌种相比,液体菌种具备生产周期短,菌龄整齐等优点。为了充分发挥液体菌种在黑鲍菇生产中的优势,本实验对液体摇瓶培养黑鲍菇菌种的部分生理进行了研究。 
    1.材料和方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2斜面母种培养基PDA培养基。 
    1.1.3液体种子培养基可溶性淀粉5%,蔗糖1%,酵母粉0.1%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%.pH值自然。 
    1.2方法 
    1.2.1液体菌种的制备将培养好的试管母种斜面菌种接入500ml盛有200ml培养液的三角烧瓶中,每瓶接入3~6块(黄豆粒大小),使其菌丝朝上悬浮于液面上,置于25℃恒温静止培养48h后放在180r/min旋转式摇床上25℃下振荡培养5d,作为液体菌种。 
    1.2.2菌丝干重的测定将培养好的菌液用4层纱布过滤,再用水冲洗干净后,置于60℃烘干箱中烘至恒重,然后称其重量。 
    2.结果与讨论 
    2.1培养基初始PH对黑鲍菇发酵的影响配置不同梯度pH的培养液,按常规分装接种摇瓶培养后,测定培养前后培养液pH,观察对比黑鲍菇生长过程中pH的变化及对菌丝体生长的影响,结果见表7。 
    表7培养基初始pH值对黑鲍菇发酵的影响 

    结果表明,培养初始pH对发酵影响很大,与正交试验结果相吻合。对照接种培养前后培养液pH的变化情况,发现黑鲍菇接种在不同PH梯度的培养液中培养,初始都将培养液pH调整到6~7左右,说明黑鲍菇生长比较理想的培养液在中性微酸环境,并在代谢过程中能分泌调节环境PH的物质,以稳定环境酸碱度。 
    2.2摇瓶装液量对黑鲍菇发酵的影响 
    用500ml三角烧瓶装入50、100、120、150、180、200、220mL的培养液进行摇瓶培养。结果见表8。 

    表8摇瓶装液量对黑鲍菇发酵的影响 
    结果表明,200ml盛液量菌丝产量最高,过多或过少的盛液量,都可能产生直径较大的菌球。 
    2.3摇瓶转速及培养方法对黑鲍菇发酵的影响 
    (1)摇瓶转速:将盛200ml发酵液的500ml三角瓶,分别置于160、180、200、220r/min的转速下进行摇瓶发酵。(2)培养方法:a.取一级斜面1cm2,接种于摇瓶中,立即旋转振荡培养。b.取一级斜面1cm2,菌面朝上,轻轻接种于摇瓶中,静止培养48h,再旋转振荡培养。结果见表9. 
    表9摇瓶转速及接种方法对黑鲍菇发酵的影响 

    结果表明,在一定范围内,转速增加,通气量增大,溶解氧量增大,菌丝生长量增多,菌丝球直径变小,当转速达到100~180r/min时,空气充足,养分丰富,菌丝沿接种块横切面方向生长,并交错形成网状结构,以后成为团粒结构的核心。当转速达到200时,速度过快,网状结构不能形成,导致菌丝团粒减少。另外,接种后静止培养48h,再上摇床振荡培养的菌丝体产量,较接种后立即振荡培养的菌丝体产量高。这可能是由于菌种块在表面培养时,空气充足,适合菌体发育,部分菌丝沿菌种横向生长,形成网状结构,以后进行振荡培养,这些网状分散成为菌丝球的核心,便于形成菌丝球。 
    2.4发酵温度对黑鲍菇菌丝球产量及大小的影响 
    将500ml摇瓶菌液置于15℃、20℃、25℃、30℃下发酵。测定培养温度对菌丝球干重及大小的影响,结果见表10。 
    表10发酵温度对黑鲍菇发酵的影响 

    从表10可以看出,在一定的温度范围内,随着温度的升高菌丝量不断增加而菌丝球直径逐渐减小,但在25℃后,继续升温,达到30℃时,菌丝量不再增加??杉?5℃为黑鲍菇适宜温度。因此,确定25℃为适宜发酵温度。 
    2.5摇瓶培养液接种量对黑鲍菇发酵的影响在500ml三角瓶中分装200ml培养液,灭菌后分别接入5%、10%、15%、20%不同量一级摇瓶菌种置于25℃,180r/min旋转式摇床振荡培养5~6d,测其接种量对菌丝生长的情况,测定菌丝干重和菌球大小。结果见表11。 
    表11摇瓶培养液接种量对黑鲍菇发酵的影响 

    从上表中说明,随着接种量从5%~10%的递增,菌丝体的产量逐渐提高,以10%~15%的接种量为宜,当接种量达到20%,菌丝的生长量无明显地增加,考虑到经济效益,确定接种量为10%。 
    2.6不同发酵时间对黑鲍菇生物量与粗多糖的影响将盛有200ml培养液的500ml三角瓶接种后,在25℃下180r/min振荡培养从72h开始测定菌丝体产量,每隔24h抽样测定一次,共测定5次,每次3瓶,求平均值,测定结果见表12。 
    表12不同培养时间的黑鲍菇菌丝体的生长情况 

    结果是摇床振荡培养4d后,培养液也呈浅黄色透明并有鲜甜的味道,从表12看出在发酵培养120~144h菌丝体的产量和粗多糖含量较高,培养120h达到高峰值,菌液于25℃平板培养菌丝长速快而健壮。168h后菌丝体的生物量急剧下降,菌球开始衰老自溶,显微镜下观察到的菌丝瘦弱。 
    2.7培养基粘度对菌丝球数量与大小的影响液体菌种在单位体积里的菌丝球数目愈多愈好,直径愈小愈好。这样可以增加菌种与培养料的接触面,有利于发菌。据报道,菌丝球的大小主要决定培养基的粘度。在一定的范围内,培养基的粘度越大,菌丝球数目越多,菌球越小。我们采用可溶性淀粉提高培养基粘度,研究培养基粘度对菌丝球数目和大小的影响,经反复试验结果见表13(25℃下培养5d)。 
    表13培养基粘度与菌球量和大小的关系(单位:个/ml.mm) 

    3.小结 
    通过系统试验确定了黑鲍菇液体发酵最适碳源为蔗糖(或红糖或玉米粉),最适氮源为酵母膏(或麦麸、蛋白胨).最适无机盐为KH2PO4和MgSO4,最适初试PH值6.0~7.0,最适装液量500ml三角瓶盛200ml,最适培养方法为接种后培养48h后振荡培养。最适摇床转速为180r/min,最适培养温度为25℃,最适接种量为10%,最适培养时间为5d。如果在培养基中加入适量粘性物质,菌丝生物量与菌球的大小会更理想。 
    (三)液体发酵罐种深层培养的初步研究. 
    1.材料和方法 
    1.1菌种:PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.2培养基: 
    1.2.1斜面培养基:PDA培养基。 
    1.2.2摇瓶培养基:可溶性淀粉5%,蔗糖1%,酵母膏1%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,PH自然。 
    1.2.3发酵罐培养基:玉米粉5~6%,红糖1%,麦麸5%,蛋白胨0.5%,KH2PO40.05%.MgSO40.05%,PH6~7。 
    1.3方法: 
    1.3.1菌种活化:将保存于冷藏箱内的PL-AD28菌株接到PDA培养基上,于25℃培养6~7d。 
    1.3.2一级摇瓶培养:500ml三角锥形瓶内装于200ml摇瓶培养基,接种2~3块黄豆大的斜面菌种,静止培养24h,于25℃,180r/min摇床振荡培养5~6d。 
    1.3.3二级摇瓶培养:500ml三角锥形瓶内装入200ml摇瓶培养基,接入10%量的一级摇瓶种子液,于25℃,180r/ml摇床振荡培养5d。 
    1.3.4深层发酵培养: 
    1.3.4.15L发酵罐培养:5L发酵罐装入4L发酵罐培养基,按10%接种量接二级摇瓶种子液,于25℃,180r/min通气培养。每24h取样检测菌丝体生长情况。 
    1.3.4.2100L发酵罐培养:100L发酵罐装人70L培养基,发酵罐内压力维持载0.03Mpa,温度为25~26℃,每24h取样检测菌丝体生长情况。 
    2.结果与讨论 
    2.1发酵罐发酵生长曲线:从图1和图2可以看出,5L、100L发酵罐菌丝收率均同培养时间呈双对数曲线关系,发酵罐培养3~4d,菌丝收率最大。 
    在培养过程中,黑鲍菇菌丝体不断生长,形成大量菌丝球,不断消耗培养基中营养成分,菌丝体干重不断增加,在96-120h达到最大,此时生物量最高。继续发酵培养,营养物质贫乏,菌丝体开始衰退,发生处溶,生物量开始下降。根据曲线分析,发酵终点应确定在84-100h。此时菌丝干重虽然不是最大,但有利于菌丝生长。 
    2.2发酵时间与PH值的关系 
    5L发酵培养,自动记录的PH变化曲线如图3。 
    由摇瓶试验可知,最适初试PH值为6~7,而培养基在灭菌过程使PH下降约0.5个位,因此在灭菌前,将培养基的PH调至6.5~7.5。从图3可看出,在适宜菌丝生长的环境下,菌丝本身具有一定调节PH值的能力,而使PH处于平稳状态。但当培养基中的碳氮比、消泡油的加入量等不适宜,菌体酒会失去调节PH的能力,培养基的PH就会发生波动。因此通过发酵过程PH变化曲线的观察,判断菌丝体是否处于适应的生长环境。 
    (四)液体种与固体种的使用效果的对比研究. 
    1、材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。按常规制成试管母种和液体种。 
    11.2培养基A.麦粒原种培养基;B.栽培袋培养基:棉籽壳50%、玉米芯30%、果渣20%、生石灰5%。(外加) 
    1.2方法 
    1.2.1麦粒培养基的制备将麦粒浸泡24h,然后加水煮至熟而不烂,即破碎无白心为宜,分装罐头瓶至瓶颈,常规灭菌后备用。 
    1.2.2栽培料袋的制备按配方配制常规发酵,将发酵好的栽培料袋装入聚乙烯塑料袋,每袋装料折干重1.2Kg,袋净装料长28cm。 
    1.2.3菌丝活力比较①将试管母种、液体种分别接入麦粒培养基,接种量均为10%。观察菌丝长满瓶时间,以确定液体种与固体种的质量差别。每一处理不同组合接种30瓶,分为3组,25℃下培养。②将制备好的棉籽壳培养料袋立即分别接入麦粒种和液体种,接种量均为10%。观察菌丝萌发时间、生长速度、满袋天数、污染率等,以确定液体种与固体种的活力差异。每个处理的不同组合接种60袋,分为三组,25℃培养。 
    1.2.4出菇比较将上述发好菌的栽培袋采用墙式立体袋栽,每个组合60袋,分为三组,常规管理,以前三潮菇作为衡量指标。 
    2、结果与分析 
    2.1菌丝活力试验结果表明,液体种、试管母种接入麦粒培养基和棉籽壳培养基,菌丝长满罐头瓶和栽培袋所需的时间差异显著。麦粒培养基分别为16d和30d,相差14d;棉籽壳培养基分别为21d和34d,相差13d,说明液体种较试管种不论在繁殖原种和栽培袋时都具有很大优势(见表14、表15)。 
    表14液体种与固体种在麦粒培养基上生长情况的比较 

    分析表14的主要原因有:其一,液体种由菌丝球组成,接种摇匀后菌球能较均匀地分散在培养基内,进行多点同步生长;其二,液体种在发酵过程中不断提供的新鲜氧气,可使菌丝细胞呼吸旺盛,细胞分裂快速,缩短了发菌时间。 
    表15液体种与固体种在棉籽壳培养基上生长情况比较 

    表15的结果与表14相似,液体种的日长速为1.07cm,而固体种为0.76cm,其差额为0.31,满袋时间提前13d,可见液体种的菌丝活力明显高于固体种。 
    2.2产量比较两种菌种的栽培试验产量有明显的差异,见表16。 
    表16液体种与固体种鲜菇产量比较(Kg) 

    从表16可以看出,袋产量相差0.18Kg,生物学效率提高15%。 
    3、讨论 
    (1)液体种缩短了制种周期,培养原种比固体菌种可提前14d长满菌瓶,培养栽培袋可提前13d发满菌袋,且菌丝生长旺盛,菌种健壮,菌龄一致,成活率高,污染率低。 
    (2)液体菌种在培养料中,同一时间内菌丝体扭结多,出菇早,转潮快,比固体菌种栽培的培养料可提前11d出菇,整个培养周期可缩短35~40d,产量高,出菇整齐,便于管理。 
    (3)液体菌种取料方便,成本低,节约能源,只要严格遵守无菌操作的规程,是值得规?;?、工厂化生产上应用的一种方法。 
    (五)液体种保存温度及有效期的试验研究 
    用深层发酵法生产液体菌种,具有产量高、周期短、菌龄齐、污染少、成本低等优点,但保存期短,接种培养好后在短期内必须使用,失去了固体种有一定的保存期的优点,与菌种厂的生产和销售不相适应,严重制约菌种厂发展黑鲍菇液体种。为了探索黑鲍菇液体种保存温 度及有效期,我们进行了如下的试验研究。 
    1材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2菌种的制备经试管斜面和液体种扩繁后,接入5L不锈钢标准发酵罐培养120~132h,菌球为1000~1200个/ml,菌丝800~850mg/100ml。 
    1.2方法 
    1.2.1平皿复活试验设0~5℃,6~10℃,11~15℃,16~20℃,21~25℃五个试验。各处理菌种以500ml三角瓶封装,置不同温度下保存。复活时,挑取大球、小球、片状分别在平板培养基上各接三个点,置25℃下培养,记录菌球萌动情况。 
    1.2.2菌种成活率试验设5个温度范围保存,每隔3d随机取10个菌球接种在琼脂平板培养基上,置25℃培养,以接种后2d菌种的萌动为准,计算成活率,共观察16d。 
    2结果与分析 
    2.1平皿复活试验:通过五种温度试验,各形态菌球均载24h萌发,随着保存天数的延长和保存温度的提高,菌球萌发时间有明显差异,见表17。 
    表17平皿复活试验(取三个点启动时间的平均数) 

    2.2菌种成活率试验:黑鲍菇液体种载0~10℃之内保存18d成活率均为100%、10℃以上随着保存时间的延长,成活率明显降低,见表18. 
    表18不同温度下保存菌种的成活率(%) 

    从上述两个表中可以看出①在相同的温度下,随保存期延长菌种成活率降低;②保存期相同,菌种成活率随温度升高而减弱;③在本试验中,保存菌种的成活率在0~10℃之内未表现出下降趋势,11~15℃之内于15d后开始下降,但下降幅度不大,16~20℃之内第9d开始下降,21~25℃之内第6d后呈急剧下降趋势;④成活率下降至95%作总和平衡黑鲍菇液体种有效期:0~10℃为18d,10~15℃为15~18d,16~20℃为9~12d,21~25℃为3d。 
    3讨论 
    3.1在平皿复活试验中,我们发现菌球的大小也是影响有效期的一个直接因素。所挑取的大球、小球和片状在同一保存时间内,其萌动速度依次为大球>小球>片状菌丝;在同一温度下保存天数也是大球>小球>片状体??蠢?,菌体大,营养量多,适应性早,萌动快,而菌球越小,尤其片状菌丝,其适应性较差,极易死亡。在此要说明的是大球要求在0.2cm左右为宜。 
    3.2在试验中我们仅作了500ml、300ml三角瓶装液体种有效期观察,有关其他的包 装方法对有效期的影响,还有待进一步研究。 
    3.3鉴于以上特点,我们认为液体种的有效期保存是受多因子制约的,不仅受温度、不同时间的影响,而且也受包装容器、菌球大小及菌龄的影响。 
    (六)液体种不同存放期出菇生物转化率的试验研究 
    1材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2培养基①母种PDA培养基。②液体培养基:玉米粉5%,蔗糖1%,酵母膏(粉)0.5%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%③固体原种及袋栽培养基:均采用调制含水量为65%的纯棉籽壳,栽培袋为17cm×33cm×0.04的聚乙烯袋,每袋装料折干250g,常规灭菌。 
    1.2方法 
    1.2.1液体种的制备在盛有15粒玻璃珠的500ml三角瓶装入液体培养基150ml,于1.1kg/cm2下灭均30分钟,冷却后每瓶接入斜面母种黄豆粒大小3~4块,置180r/min旋转方式摇瓶机上25℃震荡培养5d,并开始计算存效时间. 
    1.2.2不同温度下不同的存放期试验将摇床振荡培养5d后的液体种,按保存时间的长短依次制种,在室温25~30℃下分别存放0、1、5、7、15、25、95d,以及在冰箱中5℃下存放95d。固体种为培养35d后长满瓶的原种,以接固体种作对照。然后将不同保存期的液体种接入栽培袋。每处理3个重复,每次20袋。培养场地温度为25~26℃,空气湿度保持在65~70%,在相同条件下进行管理。菌丝长满袋后,于10~22℃,空气湿度为90~95%出菇场地出菇。 
    结果 
    2.1鲜菇产量比较结果由于液体种处于良好的生长条件,菌丝生长旺盛,日生长速度快,因此细胞内养料积累多,产量普遍高于固体种。当保存时间在1~5d内,液体种比固体种增产显著,生物效率可提高10%以上。见表19、表20。 
    表19液体种不同存放期对鲜菇产量的影响 

    从表19中说明,在室温(25~30℃)下存放1d的液体种产量最高,总产量8028g,生物效率达160.6%;存放15d以内的液体种鲜菇产量高于固体菌种;存放25d的液体种产量略低于固体菌种;存放了95d的液体种,虽然菌丝日长速也不低于6.4mm,但菌丝稀疏,生活力弱,镜检菌丝老化、瘦弱。细胞内多空泡。经新复极差测验,其差异显著性见表20。 
    表20液体种不同存放期袋产量的SSR多重比较 

    试验结果表明,黑鲍菇液体种在25~30℃,存放25d菇产量之间无显著差异,存放15d内的液体种产量高于固体种,如果在冰箱内(5℃)保存,还可以延长保存期(3个月)而对菇产量影响不大。 
    2.2出菇时间及菇质比较,结果见表21。 
    表21保存期对出菇时间和菇质的影响 

    试验结果表明,液体种在室温(25~30℃)下存放7d,对出菇时间影响不大。在一定的存放时间内,一股存放时间越长,第一潮菇出得越早,这与黑鲍菇的生长发育期有密切关系,即黑鲍菇由菌丝发育阶段到分化出菇,需要一定的生理成熟期。另外,菌种存放时间越短, 出菇时间越分散、不整齐。低温长时间保存的菌种,其显著特点是出菇整齐,这主要是同步培养效应,使菌丝处于同一生长阶段。 
    讨论 
    通过本试验表明:在气温较高的时期,室温下液体种的保存期不能超过15d,最佳保存期为1~7d,这样可比固体种提高4~12%的产量,而且菇体的质地也比较好。如果有条件的话,菌种场及菇农采用低温保存液体种,这样不但可以保证出菇产量、质量、延长保存时间,而且出菇整齐,便于管理。 
    二、黑鲍菇液体菌种优质高产模式的研究. 
    (一)培养料的筛选 
    1材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2栽培种采用500ml三角瓶装量200ml,摇床转速控制在180r/min,培养温度25℃,恒温培养4~5d,其培养液终点有特殊的“鲍鱼”美味,菌球大小均匀,无杂菌污染的二级摇瓶种。 
    1.2方法 
    1.2.1培养料处理选择无霉变、无虫害新鲜的棉籽壳、玉米芯、苹果渣(含水量在5%以下),经曝晒处理后,再将玉米芯粉碎,过直径0.5~1cm筛,备用。 
    1.2.2培养料配方由棉籽壳、玉米芯作主料、果渣、麦麸、生石灰作辅料组成11个配方(见表22) 
    表22不同配方培养料成分含量(%) 

    1.2.3栽培试验采用熟料墙式立体袋栽法。将表1中不同配方调成含水量在60~65%,装入17×33cm的聚丙烯塑料袋中,每袋折干重250g,126℃灭菌2h,冷却后,在无菌室用接种枪注射式接入液体种,接种量为10%。每个配方接20袋,25℃恒温培养,待菌丝满袋后,移入菇房,进行出菇管理。出菇温度控制在15~20℃,空气相对温度保持85~95%。 
    1.2.4生物学效率和产量计算法按20袋头三潮菇鲜菇产量的平均值。生物学效率(%)=子实体鲜重/培养料干重。 
    2结果与讨论 
    2.1菌丝生长情况不同配方其菌丝萌发时间、日长速、满袋天数、及污染率的差异见表23。 
    表23不同配方菌丝生长情况 

    从表23中可以看出,各配方的菌丝萌发时间除配方1和2稍晚外,其它无差异。在吃料时间、日长速、满袋天数及污染率上都有差异,从总的情况看,以配方7、8、9为好。 
    2.2不同培养料的生物学效率黑鲍菇PL-AD28在不同培养料中生长生物学效率不同(见表24) 
    表24黑鲍菇PL-AD28在不同培养料中的生物学效率 

    由表24说明:①用棉籽壳作主料比用玉米芯作主料的生物学效率高,这说明黑鲍菇同其他食用菌一样,棉籽壳是它的良好栽培基质。②将棉籽壳与玉米芯两种料搭配用比单一种主料生物学效率高,这与两种主料的营养互补和玉米芯具有良好的通气性有关。③在一定范围内,黑鲍菇生物学效率的高低与培养料中棉籽壳的增加存在一定的正相关。当棉籽壳增加量超过63%时,生物效率开始下降。这说明,棉籽壳虽然是一种良好的栽培基质,。但经灭菌后袋内的料易板结,故其通气性差,影响了菌丝的生长和生理成熟。因此在用苹果渣、麦麸等作辅料时,应将棉籽壳与玉米芯调到一定的比例,才能提高其生物学效率。本试验配方7、8、9生物学效率较高。因为8和9配方差异不大,加之棉籽壳比玉米芯价格高,所以本研究选配方8为最佳配方。 
    3小结 
    3.1我们山东棉籽壳和玉米芯来源广泛,价格低廉,将这两种材料搭配作主料经济效益比较高。 
    3.2本研究在各配方中加入适量的果渣,有助于黑鲍菇菌丝的生长和产量的提高。分析其原因可能果渣中含有现成的糖类和氨基酸等简单地小分子物质,这些物质能够被直接吸收利用,有利于菌丝的生长和发育。 
    3.3培养料中加入适量的果渣,既降低了成本,变废为宝,又全果汁厂解决了困难,同时也减少了环境污染。 
    (二)液体种生料栽培的研究 
    据文献,黑鲍菇液体种生料栽培仅有小试报道,迄今为止,还没有一家完全使用黑鲍菇液体菌种用于生料化生产的。为此,我们在黑鲍菇液体种熟料栽培试验的基础上,又进行了生料栽培探索,取得了良好的效果。现报告如下: 
    1材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2培养液为常规玉米粉蔗糖培养液。 
    1.1.3栽培料配方棉籽壳50%、玉米芯30%、果汁渣20%、外加5%生石灰,水适量。 
    1.2方法 
    5~6d     4~5d 
    1.2.1液体菌种生产工艺  斜面菌种   摇瓶   种子罐   25℃   25℃ 
    4~5d      4d 
       发酵罐   液体种。 
    25℃   25℃ 
    质量控制标准菌丝球直径0.5~1.5mm,含菌量(湿重)50%左右,无杂菌污染。 
    1.2.2栽培料处理选取新鲜、无病虫害,经过几天曝晒后用0.1%高锰酸钾溶液浸15~20分钟,捞出后调节料含水量60%左右棉籽壳。 
    1.2.3栽培试验采用床栽法,设三个小区,每个小区床面面积为1m2,投料15Kg, 用液体菌种250ml,以淋洒的方式使其与栽培料混合。以按常规固体栽培种作对照,固体种的用种量为罐头瓶菌种3瓶,采用分层接种方式。接种后均要压实和覆盖薄膜,当菌丝长满培养料表面后揭膜,常规进行管理。在此期间要观察的项目:观察菌丝生长情况,第10d、15d测其菌丝的生长速度;记载头潮菇的出菇时间及各小区收三潮菇的鲜菇量。 
    3结果与分析 
    3.1菌丝生长情况15天内菌丝生长的日均长速,液体菌种比固体菌种菌丝增长快0.33cm,液体菌种比固体菌种菌丝长满培养料早7天(见表25) 
    表2515天内菌丝生长情况 

    3.2头潮菇出菇期由于液体菌种菌丝长满培养料比固体菌种提早7天,所以也相应提早出菇7~8天,缩短了生产周期。 
    3.3产量比较两个菌种类型的栽培试验产量如表26 
    表26液体种生料床栽试验产量(Kg) 

    从表26中可知,液体菌种产量平均13.73Kg/m2,固体菌种产量平均11.33Kg/m2,液体种可增产2.40Kg/m2。 
    讨论与小结 
    4.1液体菌种,由于菌丝片段多,萌发点多,呈液体状态分散度大,在培养中立体生长,菌 丝大都出于生长旺盛期,发育健壮,一旦成熟菌龄一致,在同一时期内菌丝体扭结多,因此出菇早、齐、转潮快,便于管理,产量高。 
    4.2通过本研究,液体菌种生料栽培黑鲍菇是可行的,不仅可以缩短生产周期,如果培养料处理好,还可以避免杂菌污染,成本低,省工省时。 
    4.3液体种生料栽培的培养料含水量应比固体种生料栽培的含水量低,一股为50%~60%为宜。 
    (三)液体种不同播种方式的研究 
    目前,对于黑鲍菇类多采用生料或发酵料袋装固体种层播覆土式栽培。本研究用液体种,采用生料层播、条播、穴播三种不同播种方式进行畦栽试验比较。现将试验结果报告如下: 
    1材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2主要培养料土豆汁、玉米粉、棉籽壳、玉米芯、麦麸等。 
    1.2方法 
    1.2.1液体菌种的生产工艺同上述(二) 
    1.2.2栽培试验 
    1.2.2.1配方棉籽壳50%,玉米芯30%,果汁渣20%,外加5%生石灰,40%的多菌灵胶悬液0.2%,料水比1:1,投料量25Kg/m2。 
    1.2.2.2播种量①100ml/m2;②200ml/m2;③300ml/m2。上述三种菌液均用3倍水稀释。 
    1.2.2.3播种方式(1)层播,培养料分4层入畦,下层分别均匀撒播1/3菌液;(2)条播,培养料全部入畦后,在表层划沟,沟深3~4cm,沟距6~7cm,将菌液均匀撒在沟中;(3)穴播,培养料全部入畦后,在表层挖穴,穴距6~7cm,穴深3~4cm,菌液用小勺定量播入穴内。上述3种方式播种完毕后,均要将表面整平、压实、覆盖报纸和塑料薄膜。 
    1.2.2.4产量比较称量统计头潮菇的单位面积产量。 
    结果与分析 
    2.1不同播种方式的栽培结果液体种栽培黑鲍菇采用不同播种方式其结果见表27 
    表27不同播种方式的栽培结果 

    从表27可看出,播种方式以穴播最佳,主要是因为菌液入穴后,比较集中,具有群体优势,辐射生长快,而且一部分菌粒沿穴渗入到一定深度,扩大了发菌面积。 
    2.2不同播种量的栽培结果液体种畦栽培黑鲍菇用穴播方式不同播种量,其结果有明显差异(见表28) 
    表28不同接种量的穴播栽培结果 

    从表28中可以看出,加大接种量是提高黑鲍菇产量的有效方法。播种量300ml/m2,培养27d培养料菌丝全部长满,37d左右采头潮菇,仅头潮菇的生物学效率可达到76.8%。 
    3讨论与小结 
    3.1本试验是在液体菌种采用不同播种方式和不同播种量方法上的研究,其优点是接种速度快、可定量、定位接种、效果较好、发菌整齐。但对液体种的质量要求高,培养料的处理要求严格。 
    3.2液体菌种栽培黑鲍菇时,在本研究中以穴播为佳,接种量为300ml/m2。 
    (四)液体种不同栽培方式的试验研究. 
    1材料与方法 
    1.1材料 
    1.1.1供试菌株PL-AD28,由烟台师范学院食用真菌研究所提供。 
    1.1.2液体菌种发酵罐培养种。 
    1.1.3栽培原料与配方棉籽壳75Kg,玉米芯45Kg,苹果渣10Kg,外加生石灰8Kg。 
    1.2方法 
    1.2.1原料的堆积发酵按配方要求将培养料称好,加入适量水,投入搅拌机内拌匀。拌料 时,最主要是掌握含水量,坚持宁小勿大的原则,最后装袋时的水分,以握湿料成团,弃之即散为宜,这是正常发菌的关键含水量。 
    将拌匀的生料堆成宽1.0~1.5米,高0.5~1.0米,长度不限的料堆(料堆根据气温的高低可大可小)。建成料堆后,用直径5cm左右的木棍在料堆上打通气孔,每孔间隔40~50cm,然后覆盖草帘。待料内温度上升到50℃以上时进行第一次翻堆,以后保持每24h翻堆一次,如此进行3~4次即可。经过堆料发酵产生大量嗜热好氧的微生物如放线菌,这些微生物能改善其料内纤维素、半纤维素、木质素及粗蛋白等组成成分,有利于菌丝的直接吸收利用,同时诱导料堆内杂菌孢子的萌发,做到了以菌养菌、以菌克菌、诱导灭菌,发酵成功基料的标准为:料内外嗜热好氧微生物放线菌生长均匀,料有特殊的酒香味为好。 
    1.2.2基料装袋与播种原料经堆积发酵处理后,即可进行装袋与播种。袋子规格为17cm×33cm×0.02cm的聚乙烯袋内,每袋折干重300g。用接种枪喷射法在袋两端进行播种,播种量为10%。 
    1.2.3发菌将接种好的菌袋置于培养室内,温度控制在25℃±1。大约经20~22d即可发满菌袋。 
    1.2.4高产栽培方式的筛选将发满菌的菌袋搬入棚内进行出菇试验,采用以下三种方式进行栽培:(1)脱袋断面立式覆土法;(2)脱袋卧式覆土法;(3)脱袋立式覆土法。每种处理重复3次,每次随机抽145袋排列入畦中。畦长6.5m,宽0.9m,深0.15~0.28m,垄宽0.3m,袋与袋间隔0.02m,用土填充,然后罐大水,待水渗透后覆腐殖质土0.02~0.03米。观察记录每种栽培方式的出菇情况及产量。 
    高产出菇管理的措施出菇期尽量控制温度在10~25℃,保持棚内温度接近子实体生长最适温度,湿度始终保持在85~95%。在这期间所采取的措施是:(1)每潮菇采收结束后灌一次大水,出菇期只向畦面轻喷水,主要向空中、地面喷水;(2)每潮菇采收结束后不罐大水,而在出菇期每天向畦面重喷雾水,保持其畦面湿润。观察以上各个处理的出菇情况,子实体的质量及生物学效率等。 
    结果与分析 
    2.1高产栽培方式的筛选用液体种栽培黑鲍菇三种方式结果见表29。 
    表29不同栽培方式对黑鲍菇子实体的影响 

    从表29的结果可以看出:生物学效率以立埋式最高,可达196.33%,且菇体肥大,而卧埋式较差。分析其原因可能是采用立式出菇法使得出菇床单位面积上营养更加集中,表面的菌丝体一旦形成菇蕾后,深层的营养能持续不断的向子实体处输送,因而子实体也肥大。此外还可能与菌丝的生长方向有关。 
    2.2管理措施的改进常规管理往往是采用每天多次喷水保持空气相对湿度和畦面的湿润这不仅增加劳动强度,也难以保证菌体的含水量。我们在保证空气相对湿度的前提下,主要抓了采菇后进行大水满灌的措施,首先保证了菌袋内因出菇而失去水分,使菌丝能够在正常的环境下发育成熟,同时也在根本上满足了子实体对水分的吸收利用。这不仅便于管理,更重要的是提高了产量和质量。其结果见表30 
    表30灌大水与喷雾水的对比试验 

    由表30得知:采菇后灌大水,不仅保证了菌丝生长的需要,有利于生理成熟,同时也满足了子实体发育期对水分的要求,使子实体丰满肥硕,油黑光亮,不出现烂菇或死菇现象,生物转化率可达196%以上,此技术也降低了劳动强度。 
    3讨论 
    3.1从我们的栽培实践来看,采用立式覆土明显优于卧埋和断面立埋。不仅生物学效率有显著差异,而且充分利用了空间,同样的场地面积可生产出更多的产品,是最佳的栽培方式。 
    3.2首次进行菇后灌大水管理措施,提高了产量、质量、色泽及菇形等诸方面,但适当的喷水保持空气湿度还是必要的。 
    五.本项目的特色及主要创新 
    确定了黑鲍菇液体种的最适宜培养基:在了解黑鲍菇固体培养基的基础上,首先对黑鲍菇液体种的碳源、氮源及无机盐进行了筛选,通过正交试验的方法筛选出最适宜的培养基,确定了黑鲍菇液体种可以通过工业三级发酵制取,较理想的发酵罐的培养液配方:玉米粉5~6%,红糖1%,麦麸0.05%,蛋白胨0.05%(或酵母粉0.5%),KH2PO40.05%,MgSO40.05%,VB110mg/L,PH值6.0~7.0。 
    确定了黑鲍菇液体种最适宜的培养条件:不同培养条件对黑鲍菇液体种菌丝生长有明显的差异,本试验在确定最佳培养基的基础上,对培养条件进行对比研究,最终确定了最佳PH为6.0~7.0,最佳的装液量为180~200ml,接种后先静止培养48h再在摇床转速为170~180r/min,培养温度为25~26℃下震荡培养4~5d最佳。 
    确定了黑鲍菇液体种保存温度和有效期:对黑鲍菇液体种保存在温度及有效期进行了研究,确定了黑鲍菇液体种在室温(26~30℃)下存放1d生物学效率最高,存放15d以 内产出鲜菇高于固体种。在冰箱内5℃下保存3个月也不至于影响鲜菇产量。 
    首次进行了黑鲍菇液体种发酵料袋栽研究,并获得成功。确定了用接种枪定量注射式接种是本研究首选的接种方法。 
    确定了黑鲍菇液体种生料畦栽时,以穴播为佳,接种量为300ml/m2。 
    首次成功地进行了黑鲍菇液体种的规?;河?00L发酵罐培养黑鲍菇液体种成功,把现代化生物技术深层培养工艺成功地应用到黑鲍菇液体菌种生产上,确定了黑鲍菇液体种生产规程,为黑鲍菇的大规模生产奠定了基础。 
    附图说明
    图1 5L发酵罐菌丝生长曲线 
    图2 100L发酵罐菌丝生长曲线 
    图3 5L发酵罐PH变化曲线。 

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