• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 11
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩个位五码一期计划: 一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法.pdf

    关 键 词:
    一种 两维短 梯度 高效 蛋白质 组分 鉴定 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    摘要
    申请专利号:

    CN201210210614.3

    申请日:

    2012.06.20

    公开号:

    CN103512997A

    公开日:

    2014.01.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/89申请日:20120620|||公开
    IPC分类号: G01N30/89 主分类号: G01N30/89
    申请人: 北京蛋白质组研究中心
    发明人: 秦钧; 钱小红; 丁琛; 应万涛; 张养军; 卫军营; 宋雷; 江静; 张姣; 贺福初
    地址: 102206 北京市昌平区生命园路33号
    优先权:
    专利代理机构: 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人: 关畅;王慧凤
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201210210614.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.09.02|||2014.02.19|||2014.01.15

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定技术。本发明的蛋白质组分离鉴定方法,包括以下步骤:1)从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物;2)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物;3)将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离,反相色谱采用的柱温为30℃-80℃,采用流动相pH为7-12,有效梯度时间仅为26分钟;收集馏分,并对馏分进行干燥浓缩;4)将步骤3)获得的干燥浓缩样本复溶后,采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用技术进行鉴定,反相色谱采用的流动相的pH值为2-5,有效梯度时间仅为30分钟。本发明的方法在6-24小时内,假阳性率低于1%条件下,实现对6000-9000个蛋白质的分析鉴定。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种蛋白质组分离鉴定方法,其特征包括以下步骤:
    1)从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物;
    2)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物;
    3)将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离,收集馏分,并对馏分进行干燥浓缩;
    4)将步骤3)获得的干燥浓缩样本复溶后,采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法进行鉴定。

    2.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离的流动相pH值为pH 7-12;所述柱温为30℃-80℃,优选为60℃。

    3.  根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相为pH 7-12的乙腈水溶液,其中,乙腈初始浓度为2%,终止浓度为98%;
    和/或,所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中低pH短梯度反相色谱采用的流动相为pH 2-5的乙腈水溶液,优选为pH 3的乙腈水溶液,其中,乙腈初始浓度为2%,终止浓度为98%;
    所述%表示体积百分比浓度。

    4.  根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为pH 7-12的2%的乙腈水溶液,优选为pH 10的2%的乙腈水溶液,流动相B为pH 7-12的98%的乙腈水溶液,优选为pH10的98%的乙腈水溶液;
    高温高pH短梯度反相色谱采用的梯度范围设置为:1)流动相B的起始含量为(0~5)%,终止含量为(8~10)%,梯度时间为2~5分钟;2)流动相B的起始含量为(8~10)%,终止含量为(18~25)%,梯度时间为11~14分钟;3)流动相B的起始含量为(18~25)%,终止含量为(32~45)%,梯度时间为9~12分钟;4)流动相B的起始含量为(32~45)%,终止含量为95%,梯度时间为1~4分钟;5)流动相B的含量始终为95%,梯度时间为1~4分钟;6)流动相B的起始含量为95%,终止含量为5%,梯度时间为2~5分钟;
    和/或所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流速为0.2-1.5mL/min,紫外检测波长为214nm;
    所述%表示体积百分比浓度。

    5.  根据权利要求1或2或3或4所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5μm,填料孔径为10-50nm,反相色谱分离柱长度为50-500mm。

    6.  根据权利要求1-5中任意一项所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述从细胞或组织中提取蛋白质混合物的提取方法为利用6-8M尿素溶液将细胞或组织混悬后,在冰浴上超声提取蛋白质混合物。

    7.  根据权利要求1-6中所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,所述蛋白酶切方法为使用Trypsin、GluC或Lys-c中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶切。

    8.  根据权利要求1-7中任意一项所述的方法,其特征在于:所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中低pH短梯度反相色谱采用的流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为pH 2-5的2%乙腈水溶液,优选为pH 3的2%乙腈水溶液,流动相B为pH 2-5的98%乙腈水溶液,优选为pH 3的98%乙腈水溶液;流动相B的初始含量为0,终止含量为30%,所述%表示体积百分比浓度。
    和/或,根据步骤3)获得的馏分集先后顺序,每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30%;所述%表示体积百分比浓度。

    9.  根据权利要求1-8中任意一项所述的方法,其特征在于:所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法采用反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5μm,填料孔径为10-50nm,反相色谱分离柱长度为50-500mm;
    和/或,所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中反相色谱流速为100-500nL/min。

    10.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法使用电喷雾串联质谱技术鉴定。

    说明书

    说明书一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法
    技术领域
    本发明涉及一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法。
    背景技术
    蛋白质组学不仅研究特定细胞、组织、体液及亚结构中蛋白质的组成和表达变化,而且还研究蛋白质异构体、翻译后修饰及其相互作用及功能等,其中蛋白质组与基因组的对接是一项重要研究内容,但其前提之一是实现对蛋白质组的高覆盖率鉴定,而采用何种蛋白质组学分析策略是实现上述研究的关键。目前,有两种蛋白质组学分析策略:一是基于凝胶电泳分离-质谱鉴定的技术策略;二是高效液相色谱分离-质谱鉴定的技术策略。随着蛋白质组技术的发展,基于多维液相色谱-串联质谱联用的技术已经成为蛋白质组研究中的主流技术,广泛应用于蛋白质组表达、修饰及蛋白复合物等的研究中。这种分析技术的改进有助于提高蛋白质组的鉴定覆盖率。
    由于生物样本中蛋白质组成的高度复杂性,在多维液相色谱-串联质谱联用技术应用过程中,质谱分析时的离子抑制效应和质谱扫描速度的限制,致使许多肽段不能被检出,严重影响了蛋白质组的鉴定覆盖率。为了解决这个问题,已经发展了多种提高蛋白质/多肽分离和质谱检测效率的方法。例如,在分离部分采用离子交换-反相液相色谱分离技术、超长梯度分离技术和超长色谱柱分离等;在质谱鉴定部分采用高雾化效率离子源、多次重复实验和质谱分段扫描等。虽然这些方法可有效提高蛋白质组鉴定的覆盖率,但它们存在一个共同的缺点,就是需要较长的分析时间,严重影响了生物样本分析的通量和效率。因此有必要建立一种快速高效的蛋白质组分离鉴定技术。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种快速高效蛋白质组分离鉴定技术。
    本发明所提供的蛋白质组分离鉴定方法,如图1所示,包括以下步骤:
    1)从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物;
    2)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物;
    3)将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离,收集馏分,并对馏分进行干燥浓缩;
    4)将步骤3)获得的干燥浓缩样本复溶后,采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用技术进行鉴定。
    所述步骤1)从细胞或组织中提取蛋白质混合物的提取方法为:利用6~8M尿素溶液将细胞或组织混悬后,在冰浴上超声提取蛋白质混合物;
    所述步骤2)蛋白酶切方法为:使用Trypsin、GluC或Lys-c中的一种或两种以上 蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶切。
    所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离的流动相pH值为pH 7-12;所述柱温为30℃-80℃,优选为60℃。
    具体的,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 7-12的2%乙腈水溶液(体积百分比浓度,下同;用氨水调节pH值),具体可以为pH 10的2%的乙腈水溶液,流动相B为pH 7-12的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),具体可以为pH 10的98%的乙腈水溶液。
    反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5μm,填料孔径为10-50nm,反相色谱分离柱长度为50-500mm。
    有效梯度时间最低为26分钟,具体设置为:1)流动相B的起始含量为(0~5)%,终止含量为(8~10)%,梯度时间为2~5分钟;2)流动相B的起始含量为(8~10)%,终止含量为(18~25)%,梯度时间为11~14分钟;3)流动相B的起始含量为(18~25)%,终止含量为(32~45)%,梯度时间为9~12分钟;4)流动相B的起始含量为(32~45)%,终止含量为95%,梯度时间为1~4分钟;5)流动相B的含量始终为95%,梯度时间为1~4分钟;6)流动相B的起始含量为95%,终止含量为5%,梯度时间为2~5分钟;所述%表示体积百分比浓度。
    所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流速为0.2-1.5mL/min,紫外检测波长为214nm。
    所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 2-5的2%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值),流动相B为pH 2-5的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。
    反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5μm,填料孔径为10-50nm,反相色谱分离柱长度为50-500mm。流速为100-500nL/min。
    根据第一维馏分的收集先后顺序,如图2所示,进行针对性梯度设置,根据步骤3)获得的馏分集先后顺序,每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30%;所述%表示体积百分比浓度。有效梯度时间仅为30分钟。如图3所示,所述质谱鉴定系采用电喷雾质谱仪进行分析鉴定。
    本发明方法的特征在于对复杂生物蛋白质组的仪器分析效率达到6-24小时内实现在假阳性率低于1%时,对6000-9000个蛋白质的分析鉴定。
    附图说明
    图1为本发明方法的技术路线图
    图2为实施例1获得的样品的梯度设置示意图和总离子流色谱图
    图3为实施例2获得的样品的总离子流色谱图
    图4为实施例3获得的样品的总离子流色谱图
    具体实施方式
    实施例1
    将Hela细胞混悬于8M尿素溶液,在冰浴上超声提取蛋白质混合物,并使用Trypsin进行酶切,得到其肽段混合物。
    将从Hela细胞中提取的400μg蛋白混和物酶切后,进行一维反相色谱分离,采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值)。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司,反相色谱分离柱填料粒径为5μm,填料孔径为15nm,反相色谱分离柱为4.6×250mm。梯度设置为第一梯度:流动相B的初始含量为5%,终止含量为8%,梯度时间为2分钟;第二梯度:流动相B的初始含量为8%,终止含量为18%,梯度时间为11分钟;第三梯度:流动相B的初始含量为18%,终止含量为32%,梯度时间为9分钟;第四梯度:流动相B的初始含量为32%,终止含量为95%,梯度时间为1分钟;第五梯度:流动相B的含量始终为95%,梯度时间为1分钟;第六梯度:流动相B的初始含量为95%B,终止含量为5%,梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min,紫外检测波长为214nm,柱温为60℃。从第2分钟开始收集馏分,共得到24个馏分。并用Savant SPD 2010真空离心干燥机(Thermo公司)对馏分进行浓缩干燥,干燥温度设置为45℃,至馏分完全干燥。上述%表示体积百分比浓度。
    将获得的干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后,依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值),流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料,反相色谱分离柱填料粒径为3μm,填径为30nm,反相色谱分离柱为75μm×150mm。流速为380nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序,进行针对性梯度设置(如图2所示),每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为 4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30%;上述%表示体积百分比浓度。质谱采集系统为5600Q-TOF质谱仪(美国AppliedBiosystems公司),扫描采用数据依赖模式:进行一个全扫描(扫描范围m/z 350-1250),选择最强的50个母离子进行二级扫描(信号阈值为120cps)。电喷雾电压1800V,正离子模式。得到的总离子流色谱图如图2所示。24个馏分经采集分析后,在假阳性率低于1%时,12小时(30分钟*24个馏分)共鉴定到8035个蛋白质。
    实施例2
    C57小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。将从小鼠肝脏得到的细胞核提取物混悬于8M尿素溶液,在冰浴上超声提取其蛋白质混合物,并使用Trypsin进行酶切,得到其肽段混合物。
    将鼠肝细胞核提取的400μg蛋白混和物酶切后,进行一维反相色谱分离,采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值)。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司,反相色谱分离柱填料粒径为5μm,填料孔径为15nm,反相色谱分离柱为4.6×250mm。梯度设置为第一梯度:流动相B的初始含量为5%,终止含量为8%,梯度时间为2分钟;第二梯度:流动相B的初始含量为8%,终止含量为18%,梯度时间为11分钟;第三梯度:流动相B的初始含量为18%,终止含量为32%,梯度时间为9分钟;第四梯度:流动相B的初始含量为32%,终止含量为95%,梯度时间为1分钟;第五梯度:流动相B的含量始终为95%,梯度时间为1分钟;第六梯度:流动相B的初始含量为95%,终止含量为5%,梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min,紫外检测波长为214nm,柱温为60℃。从第2分钟开始收集馏分,共得到24个馏分。并用SavantSPD 2010真空离心干燥机(Thermo公司)对馏分进行浓缩干燥,干燥温度设置为45℃,至馏分完全干燥。上述%表示体积百分比浓度。
    将获得的干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后,依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值),流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料,填料粒径为3μm,填料孔径为30nm,反相色谱分离柱为75μm×150mm。流速为300nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序,进行针对性梯度设置,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类 推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30%;上述%均表示体积百分比浓度。质谱采集系统为线性轨道离子阱质谱仪(LTQ-Orbitrap-Velos,Thermo公司),扫描采用数据依赖模式:进行一个全扫描(扫描范围m/z 350-2000),选择最强的20个母离子进行二级扫描(信号阈值为1000)。电喷雾电压1700V,正离子模式。得到的总离子流色谱图如图3所示。24个馏分经采集分析后,在假阳性率低于1%时,12小时(30分钟*24个馏分)共鉴定到6684个蛋白质。
    实施例3
    将Hela细胞混悬于8M尿素溶液,在冰浴上超声提取蛋白质混合物,并使用Trypsin进行酶切,得到其肽段混合物。
    将从Hela细胞中提取的400μg蛋白混和物酶切后,进行一维反相色谱分离,采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值)。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司,反相色谱分离柱填料粒径为5μm,填料孔径为15nm,反相色谱分离柱为4.6×250mm。梯度设置为第一梯度:流动相B的初始含量为5%,终止含量为8%,梯度时间为2分钟;第二梯度:流动相B的初始含量为8%,终止含量为18%,梯度时间为11分钟;第三梯度:流动相B的初始含量为18%,终止含量为32%,梯度时间为9分钟;第四梯度:流动相B的初始含量为32%,终止含量为95%,梯度时间为1分钟;第五梯度:流动相B的含量始终为95%,梯度时间为1分钟;第六梯度:流动相B的初始含量为95%B,终止含量为5%,梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min,紫外检测波长为214nm,柱温为60℃。从第2分钟开始收集馏分,共得到24个馏分。并用Savant SPD 2010真空离心干燥机(Thermo公司)对馏分进行浓缩干燥,干燥温度设置为45℃,至馏分完全干燥。上述%均表示体积百分比浓度。
    将获得的每个干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后,分为等量的两份样品,依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值),流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料,反相色谱分离柱填料粒径为3μm,填径为30nm,反相色谱分离柱为75μm×150mm。流速为380nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序,进行针对性梯度设置(如图2所示), 每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30%;上述%均表示体积百分比浓度。质谱采集系统为Q Exactive质谱仪(Thermo公司),扫描采用数据依赖模式:进行一个全扫描(扫描范围m/z 400-1400),选择最强的75个母离子进行二级扫描(信号阈值为6300)。电喷雾电压1900V,正离子模式。得到的总离子流色谱图如图4所示。所有馏分经采集分析后,在假阳性率低于1%时,24小时(24个馏分*30分钟=12小时,重复进行一次实验)共鉴定到9032个蛋白质?!  ∧谌堇醋宰ɡ鴚ww.www.4mum.com.cn转载请标明出处

    关于本文
    本文标题:一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-5775847.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
  • ag真人视讯包赢技术 香港 水果奶奶免费资料 澳洲幸运8玩法 陕西十一选五开多少期 腾讯欢乐捕鱼海神 浙江快乐12彩开奖号码查询 快乐赛车手 云南11选5开奖号码直播 重庆百变王牌计划群 羽毛球英语单词怎么读 广东好彩1最新开奖 天津十一选五14期开奖结果 欢乐捕鱼下载 急速赛车6 大乐透137历史汇总 中国山东时时彩