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    重庆时时彩走势图开奖直播: 蛋白CD38在制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用.pdf

    关 键 词:
    蛋白 CD38 制备 类风湿性关节炎 诊断 标记 中的 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201310483384.2

    申请日:

    2013.10.16

    公开号:

    CN103513040A

    公开日:

    2014.01.15

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20131016授权公告日:20150311终止日期:20151016|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20131016|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 常晓天
    发明人: 常晓天
    地址: 250014 山东省济南市历下区经十路16766号
    优先权:
    专利代理机构: 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 代理人: 彭成
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310483384.2

    授权公告号:

    |||103513040B||||||

    法律状态公告日:

    2016.11.30|||2015.03.11|||2014.02.19|||2014.01.15

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38。本发明的申请人通过流式细胞实验证明,与正常人相比,RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞高表达,且其表达水平与RF水平显著相关。此外,流式检测结果显示,CD38+CD56+细胞亚群的比例也明显升高,而CD56是自然杀伤细胞(NK细胞)的细胞表面标志物,这提示CD38在RA自身免疫紊乱中起到重要作用,可以作为类风湿性关节炎诊断标记物。一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒,由FITC标记的CD3、CD4单克隆抗体,PE标记的CD56单克隆抗体及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体组成。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  蛋白CD38在作为或制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用。

    2.  蛋白CD38在制备检测类风湿性关节炎的试剂盒中的应用。

    3.  一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒,其特征在于:由FITC标记的CD3和CD4单克隆抗体,PE标记的CD56单克隆抗体,以及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体组成。

    说明书

    说明书蛋白CD38在制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用
    技术领域
    本发明涉及蛋白CD38在作为/制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用。
    背景技术
    类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫疾病,发病率为千分之三点五。目前,临床都是通过检测患者外周血中的类风湿因子(rheumatic factor,RF)和抗瓜氨酸化自我免疫抗(anti-CCP)为RA提供临床诊断依据。由于检测RF和anti-CCP的手段均基于抗原抗体特异性结合的ELISA技术,因此,实验步骤多、耗时长、假阳性率高。另外,由于我国无上述两检测标志物的知识产权,该试剂盒市场价格4000余元,医院每人份的检测费用200~260余元。
    RA主要病变部位为关节滑膜。本发明的申请人用蛋白质组学方法对RA滑膜蛋白质谱进行了检测。通过与骨关节炎(OA)和强直性脊柱炎(AS)滑膜相比较,发现蛋白CD38在RA滑膜中特异性高表达。CD(Cluster of Differentiation)中文为白细胞分化抗原,可作为各类白细胞的细胞表面标记物。CD38分子分布于不成熟的造血细胞和活化的T、B淋巴细胞、NK细胞的细胞表面,在细胞活化、黏附活性、信号转导、细胞因子产生等过程中起着重要的作用。近来研究发现,CD38功能丧失与免疫应答损伤、代谢紊乱密切相关,可能参与自身免疫性疾病的发病过程。RA滑膜中含有大量T细胞和B细胞及其它淋巴细胞,因此申请人检测出特异表达的CD与RA组织病理学相一致的。
    根据以上发现,本发明的申请人采用流式细胞术继续对RA患者外周血的CD38淋巴细胞亚群进行检测分析,希望能够深入了解CD38在RA患者外周血及滑膜中的表达情况,进一步了解RA发病的免疫机理和潜在的临床用途。流式细胞仪(英文名称:flow cytometer;FCM)技术是将流体喷射技术、激光技术、能谱术技术、电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种先进的检测技术。流式细胞仪通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度,可以高速分析成千上万个细胞,并能同时对一个细胞中多个细胞特征参数进行定性或定量分析。由于流式细胞仪具有速度快、精度高、准确性好、操作简便等特点,目前县区级及以上医院大都配备该设备用于对患者外周血进行检测。通过对各类细胞表面标记物尤其是各类CD的分析,流式细胞仪可以检测肿瘤细胞、白血病淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞的细胞数量、比例,还可以对这些细胞进行免疫分型。流式细胞仪是常见的、低成本和快速的检测方法。
    发明内容
    针对上述现有技术,本发明提供了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38,本发明还提供了以蛋白CD38为细胞标记物制备的试剂盒及其在临床检测中的应用。
    本发明的申请人通过流式细胞实验证明,与正常人相比,RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞高表达,且其表达水平与RF水平显著相关。此外,流式检测结果显示,CD38+CD56+细胞亚群的比例也明显升高,而CD56是自然杀伤细胞(NK细胞)的细胞表面标志物,这提示CD38在RA自身免疫紊乱中起到重要作用,有助于我们更清楚地了解RA发病的免疫机制和疾病活动状况。更重要的是,申请人发现CD38是很好的潜在的RA标志物,可用于该病的临床检测。鉴于上述理由,本发明的申请人发明了以CD38作为RA标记物的流式细胞临床诊断试剂盒。该试剂盒一改依托ELISA技术为基础的常用的RF和anti-CCP检测试剂,利用流式细胞术方便、快捷、灵敏和低成本的优势。由于只需要一个CD38抗体和各医院均配备的流式细胞仪,检验价格可降至25~50元/每人份,检测时间也降至40分钟。
    一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒,由FITC标记的CD3、CD4单克隆抗体,PE标记的CD56单克隆抗体及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体组成。
    进一步地,所述试剂盒中,各抗体的用量均为20μl。
    所述试剂盒,在应用时,使用方法为:取待检测者的200μl外周血以及相应流式抗体各20μl置流式上样管中,4℃避光孵育30min,利用Q-Prep Workstation(Beckman公司,美国)进行血液标本制备后置FACSAriaTMII流式细胞仪(BD Biosciences)上机检测。本发明进行了相关的实验研究,结果显示,RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为17.29±5.93%,健康人外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为10.15±3.3%,RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞的比例明显高于健康人(p=1.92E-09)。在其他指标中,RA组患者外周血中CD38+CD56+细胞的比例为8.04±5.26%,健康人者周血中的CD38+CD56+细胞的比例为0.0556±0.0264%,RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+CD56+细胞的比例明显高于健康人(p=0.007)。因此,通过本发明的实验的结果,可以确信蛋白CD38可作为类风湿性关节炎诊断标记物进行应用,检测诊断标准为:若患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例高于15%,则被检测患者应诊断为患有类风湿性关节炎。
    本发明基于发现通过流式细胞术可检测出CD38在RA外周血中高表达,提供了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38,还提供了一种以蛋白CD38为细胞标记物的试剂盒,具有简便、快速、成本低等优点。
    具体实施方式
    下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
    实施例1 通过流式细胞术检测CD38在RA外周血中的表达
    本发明的申请人对103位20~74岁的RA患者进行静脉穿刺采集血液标本,其中75人为女性。外周血被采集至EDTA-K2抗凝的真空采血管。所有患者的选取符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACA)对RA的诊断标准:患者关节均存在三年以上的慢性炎症,其红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)及类风湿因子(rheumatoid factor,RF)检测值均明显高于正常范围,分别为19~22mm/H,8~196U/ml及10.5~2,090U/ml。研究以包括80名女性在内的120位24~58岁的健康人为对照。
    本发明的申请人取200μl外周血与相应流式抗体各20μl置流式上样管中,4℃避光孵育30min,利用Q-Prep Workstation(Beckman公司,美国)进行血液标本制备后置FACSAriaTMII流式细胞仪(BD Biosciences)上机检测。该实验中使用的流式抗体包括:FITC标记的CD3、CD4、CD22单克隆抗体(Beckman),PE标记的CD56、CD25、CD19单克隆抗体(Beckman)及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体(Biolegend)。
    本发明的申请人研究利用流式细胞法对RA患者及健康人外周血中的CD38及其他免疫标记物进行检测。结果发现,70%患者外周血淋巴细胞都高表达CD38,RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为17.29±5.93%,健康人外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为10.15±3.3%,RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞的比例明显高于健康人(p=1.92E-09)。在其他指标中,RA组患者外周血中CD38+CD56+细胞的比例为8.04±5.26%,健康人者周血中的CD38+CD56+细胞的比例为0.0556±0.0264%,RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+CD56+细胞的比例明显高于健康人(p=0.007),表达上调较为明显。而在健康人中,几乎所有人淋巴细胞低表达CD38。流式检测结果详见表1。本发明的申请人也检测了38例AS患者外周血中CD38的表达,几乎所有AS患者淋巴细胞低表达CD38,只有各两例AS患者外周血淋巴细胞中度表达CD38。
    本发明的申请人对RA患者外周血中CD38表达水平与ESR,CRP和RF的关系也进行了研究,发现CD38阳性细胞的表水平与RF水平成显著相关(p=0.026),而与ESR(p=0.102)、CRP(p=0.112)的相关性不大。
    表1.流式细胞术淋巴亚群分析结果

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