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    重庆时时彩独胆怎么看: 一种用于检测PRRSV的TAQMANREALTIMERTPCR试剂盒.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201310268535.2

    申请日:

    2013.06.29

    公开号:

    CN103305637A

    公开日:

    2013.09.18

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/70申请日:20130629|||公开
    IPC分类号: C12Q1/70; C12Q1/68; G01N21/64 主分类号: C12Q1/70
    申请人: 中国农业科学院兰州兽医研究所
    发明人: 刘湘涛; 田宏; 吴锦艳; 陈妍; 尚佑军; 尹双辉; 王光祥; 张克山; 杨顺利; 刘永杰; 宋江伟
    地址: 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
    优先权:
    专利代理机构: 甘肃省知识产权事务中心 62100 代理人: 鲜林
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310268535.2

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2013.10.23|||2013.09.18

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种用于检测PRRSV的Taqman?Real-timeRT-PCR试剂盒,包含OneStepRT-PCRbufferIII、ExTaqHS、PrimerScriptRTEnzymeMixII、阴性对照、阳性对照、以及序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。本发明将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成,检测时间缩短,无需电泳就可直观反应检测结果,从而有利于快速检测;同时闭管操作可以有效防止反应产物的污染。本发明使用了探针法,只有当探针特异的结合到扩增靶序列上时才会产生有效的结果,具有更高的准确性,有助于PRRSV的防控和隐性带毒动物的剔除。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,包含One Step RT?PCR bufferIII、Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II、阴性对照,其特征在于:还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。

    2.   根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为:
    SEQ ID NO:1:上游引物CCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGT,
    SEQ ID NO:2:下游引物GGCTTCTCCGGGTTTTTCTTCCTA。

    3.   根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述探针引物序列为:
    SEQ ID NO:3:TGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGT。

    4.   根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物浓度均为10pmol/μL,扩增引物及探针引物配比为1:1:1。

    5.   根据权利要求1或2所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述扩增引物扩增出的条带序列为:
    序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延长的序列;
    SEQ ID NO:4(228bp):
    cccgggttgaaaagcctcgtgttgggtggcagaaaagctgttaagcagggagtggtaaaccttgttaaatatgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagcc。

    6.   根据权利要求1或3所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述探针引物的5’端标记物为FAM报告荧光基团、3’端标记物为TAMRA淬灭荧光基团。

    7.   根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述阳性对照为构建的pMD?228阳性质粒,该质粒是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所扩增的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列,长度228bp,克隆至pMD?18T克隆载体,命名为pMD?228。

    8.   根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒,其特征在于所述试剂盒组分的配比为: 
    a. 2×One Step RT?PCR bufferIII:25份;
    b. Ex Taq HS:1份;
    c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 1份;
    d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份,228bp上游引物2份,228bp下游引物2份,探针引物2份;
    e. 无RNA酶水13份;
    f. 阳性对照pMD?228阳性质粒6份;
    g. 阴性对照无RNA酶水6份。

    9.   一种如权利要求1所述用于检测PRRSV的Taqman Real?time RT?PCR试剂盒的使用方法,其特征在于包括以下步骤:
    a.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT?PCR扩增,条件如下:42℃反转录5min;94℃预变性2min; 94℃ 20s,退火温度57℃ 30 s,72℃ 20 s,40个循环;
    b. 结果分析
    根据扩增结果判定:在NTC没有Ct值的情况下,Ct值<35判为阳性;Ct值介于35?40为可疑,需重复检测;再次测定时该样品Ct值<35为阳性,Ct值≥35为阴性。

    关 键 词:
    一种 用于 检测 PRRSV TAQMANREALTIMERTPCR 试剂盒
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