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    小鹿网络重庆时时彩: 多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法及其应用.pdf

    关 键 词:
    阿魏 挥发油 指纹 图谱 构建 方法 及其 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201310179134.X

    申请日:

    2013.05.15

    公开号:

    CN103308638A

    公开日:

    2013.09.18

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 30/88申请公布日:20130918|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20130515|||公开
    IPC分类号: G01N30/88 主分类号: G01N30/88
    申请人: 新疆医科大学
    发明人: 盛萍; 王飒; 苗莉娟; 安露莎
    地址: 830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市新医路393号
    优先权:
    专利代理机构: 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 代理人: 蒋常雪
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310179134.X

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.01.27|||2013.10.23|||2013.09.18

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法,包括多伞阿魏挥发油的提取、多伞阿魏挥发油化学成分的GC/MS分析、多伞阿魏的GC/MS总离子流图的确定和指纹图谱的建立步骤。多伞阿魏挥发油的质量直接关系到其临床用药的安全,为全面有效地评价多伞阿魏挥发油的质量,同时为了开发抗肿瘤新药,使多伞阿魏资源得到充分的利用,发挥其独特的药理活性,本发明提供了一种多伞阿魏挥发油GC-MS指纹图谱的构建及多伞阿魏挥发油的抗胃癌新用途,包括多伞阿魏挥发油成分的制备及其指纹图谱的构建;为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择,为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供了科学依据。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法,其特征在于,具体步骤为:
    (1)多伞阿魏挥发油的提?。翰杉嗌“⑽貉?,按《中国药典》2010版一部附录XD挥发油测定法项下甲法进行,读取刻度,收集多伞阿魏挥发油,加无水硫酸钠脱水,即得供试品溶液,储存于?4℃冰箱备用;
    (2)多伞阿魏挥发油化学成分的GC/MS分析:不同产地的多伞阿魏药材不少于20批次,按照步骤(1)制备得到多伞阿魏挥发油,分别进样,进行色谱分析,得到气相色谱图;
    (3)多伞阿魏的GC/MS总离子流图的确定:通过质谱数据系统检索,鉴定化合物,并对各组分的相对含量采用峰面积归一化法进行定量;
    (4)指纹图谱的建立:测定不少于20批次的不同产地的多伞阿魏挥发油样品并进行分析比较,得到由其共有特征峰构成的多伞阿魏挥发油样品的标准指纹图谱。

    2.   一种多伞阿魏挥发油的应用,其特征在于,将多伞阿魏挥发油用于抗胃癌。

    说明书

    说明书多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法及其应用
    技术领域
    本发明涉及一种多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法及其应用,包括多伞阿魏挥发油成分指纹图谱的构建及多伞阿魏挥发油的抗胃癌新用途,属药物分析、应用领域。
    背景技术
    胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤。在我国,胃癌的发病率和病死率高居各种恶性肿瘤之首。据2000年资料统计,全球每年新发胃癌876000例,每年约有647000人因胃癌死亡。本病预后差,早期胃癌一般多无病状,一旦出现已为中晚期,其术后5年生存率仅为20?30%,进展期胃癌的自然病程一般不到1年。因此,胃癌正在严重威胁到世界人民和中国人民的健康。
    中医药治疗肿瘤,是中国在肿瘤治疗领域的一大特色,研发中医药治疗胃癌的药物应该引起足够重视,中医药在治疗胃癌方面的巨大潜力有待挖掘。
    多伞阿魏(Ferula ferulaeoides(Steud.)Korov.)是新疆维吾尔族人民常用的重要药材,为伞形科阿魏属植物,仅分布于新疆古尔班通古特沙漠南缘地区的沙丘、沙地和砾石质的蒿属荒漠中,资源丰富,药用部位为根和油胶树脂。在新疆民间广泛用作中药阿魏的代用品,其挥发性成分是其主要活性成分,在治疗虫积、肉积、痞块、心腹冷痛、疟疾、痢疾等方面具有显著的药理活性,在临床上用于治疗心腹冷痛、慢性肠胃炎、胃溃疡、风湿性关节炎等疾病。
    目前对多伞阿魏挥发性成分的研究报道主要涉及挥发油提取、化学成分分析、药理作用(具体可参见文献1:能元君,刘发,叶尔波等著《新疆三种阿魏对胃肠道作用的比较》,见新疆医学院学报,1993年第16(4)期;及文献2:叶尔波,刘发,能元君等著《新疆三种阿魏的抗炎与免疫抑制作用》,见西北药学杂志,1993年第8(2)期,第72?76页)及生药方面研究,迄今未见多伞阿魏挥发油的GC?MS指纹图谱及多伞阿魏挥发油在抗胃癌活性方面的研究报道。
    中药指纹图谱技术包括化学指纹图谱技术和DNA指纹图谱技术?;е肝仆计紫抵钢幸┚实贝砗?,采用一定的分析手段,得到能够反映中药所含内在化学成分的种类和数量,进而反映中药的质量?;е肝仆计准际跏枪使系挠行Э刂铺烊徊锬谠谥柿康募际?。其具有以下优点:(1)指纹图谱的唯一性可用于鉴别中药的真伪及产地;(2)指纹图谱的全息性可用于反映中药质量的优劣;(3)指纹图谱主要特征峰的相对稳定性能够有效控制中药的质量,确保产品的相对稳定。即指纹图谱技术是一种能全面反映药材中所含化学成分的种类、数量,达到全面评价药材质量的技术手段。
    发明内容
    本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷,提供一种多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法及其应用,包括多伞阿魏挥发油成分的制备及其指纹图谱的构建;包括多伞阿魏挥发油的应用,为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择,为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供了科学依据。
    为解决上述问题,本发明采用如下技术方案:
    本发明提供了一种多伞阿魏挥发油指纹图谱的构建方法,具体步骤为:
    (1)多伞阿魏挥发油的提?。翰杉嗌“⑽貉?,按《中国药典》2010版一部附录XD挥发油测定法项下甲法进行,读取刻度,收集多伞阿魏挥发油,加无水硫酸钠脱水,即得供试品溶液,储存于?4℃冰箱备用;
    (2)多伞阿魏挥发油化学成分的GC/MS分析:不同产地的多伞阿魏药材不少于20批次,按照步骤(1)制备得到多伞阿魏挥发油,分别进样,进行色谱分析,得到气相色谱图;
    (3)多伞阿魏的GC/MS总离子流图的确定:通过质谱数据系统检索,鉴定化合物,并对各组分的相对含量采用峰面积归一化法进行定量;
    (4)指纹图谱的建立:测定不少于20批次的不同产地的多伞阿魏挥发油样品并进行分析比较,得到由其共有特征峰构成的多伞阿魏挥发油样品的标准指纹图谱。
    本发明同时提供了一种多伞阿魏挥发油的应用,将多伞阿魏挥发油用于抗胃癌。
    多伞阿魏挥发油的质量直接关系到其临床用药的安全,为全面有效地评价多伞阿魏挥发油的质量,同时为了开发抗肿瘤新药,使多伞阿魏资源得到充分的利用,发挥其独特的药理活性,本发明提供了一种多伞阿魏挥发油GC?MS指纹图谱的构建及多伞阿魏挥发油的抗胃癌新用途,包括多伞阿魏挥发油成分的制备及其指纹图谱的构建;包括多伞阿魏挥发油的抗胃癌新用途,为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择,为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供了科学依据。
    本发明提供的多伞阿魏挥发油质量稳定、可控,制备方法简单,便于大生产和临床使用。
    具体实施方式
    实施例1 多伞阿魏挥发油成分的制备及其指纹图谱的构建
    (1)多伞阿魏挥发油的提?。翰杉煌氐亩嗌“⑽貉?,按《中国药典》2010版一部附录XD挥发油测定法项下甲法进行,读取刻度,收集多伞阿魏挥发油,加无水硫酸钠适量脱水,即得供试品溶液,储存于?4℃冰箱备用。
    (2)多伞阿魏挥发油化学成分的GC/MS分析:不同产地的多伞阿魏药材不少于20批次,按照步骤(1)制备得到多伞阿魏挥发油,分别进样,进行色谱分析,得到气相色谱图。
    GC条件:毛细管PE?5MS色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm),载气为高纯度氦气(体积分数为99.999%)。色谱柱初始温度60℃,保持5min,然后以2℃/min程序升温至180℃,再以4℃/min程序升至260℃,保持20min。进样口温度为280℃,分流比为50∶1,氦气流速为15psi;载气为高纯度氦气(体积分数为99.999%)。
    MS条件:离子源:200℃;传输线:200℃;扫描范围:35?550amμ;功率:70ev;电离方式:EI;光电倍增:270V;进样量:0.8μl。
    (3)多伞阿魏的GC/MS总离子流图的确定:通过质谱数据系统检索,鉴定化合物,并对各组分的相对含量采用峰面积归一化法进行定量。
    (4)指纹图谱的建立:测定不少于20批次的不同产地的多伞阿魏挥发油样品并进行分析比较,得到由其共有特征峰构成的多伞阿魏挥发油样品的标准指纹图谱。
    本实施例制备的多伞阿魏挥发油质量稳定、可控,制备方法简单,便于大生产和临床使用。
    实施例2 MTT法检测多伞阿魏挥发油对SGC?7901细胞增殖的抑制作用
    用0.25%胰蛋白酶消化SGC?7901细胞,用完全培养基配单细胞悬液,以每孔0.4×104个接种于96孔板中,每孔100μL。培养24h,待细胞贴壁并进入对数生长期后饥饿细胞4h,并进行实验干预。
    实验分3组:阴性对照组(100μL RPMI1640+0.1%DMSO);阳性对照组;供试样品处理组。其中,每组设5个复孔,于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中继续培养12h后中止实验,取出96孔板,每孔加入10μL MTT染色液,继续培养4h。吸弃上清,每孔加入100μL Formanzan,置摇床上低速振荡10?30min,使结晶充分溶解。以上实验重复3次。在酶联免疫检测仪570nm处测定吸光度(A)值,按下式求出生长抑制率(IR),并求出半数抑制浓度(IC50)。
    细胞生长抑制率%(IR)=(1?用药组平均A值/阴性对照组平均A值)×l00%。
    MTT数据均采用x±s表示,采用SPSS10.0软件包进行方差分析,以P≤0.05为有统计学差异。
    结果:多伞阿魏挥发油在一定的的浓度范围内,对胃癌细胞SGC?7901细胞的生长具有明显的抑制作用,与对照组比较差异显著,且随着药物质量浓度增加,细胞抑制率越高,呈现显著的浓度依赖性。多伞阿魏挥发油作用24h的IC50是23.18μg/mL。
    实施例3 倒置显微镜观察给药后细胞形态变化
    选用对数生长期的胃癌细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化数分钟后,加入含有胎牛血清的培养基终止消化,离心去除培养基,每种细胞株加入对应的培养基配制成1×105个/ml的细胞悬液,接种在96孔培养板中,每孔接种100μl,96孔培养板四周的孔加PBS,不接细胞,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养24h,使其贴壁。24小时后分别对每个细胞加入不同浓度多伞阿魏挥发油,使终浓度为IC50,分别于24h,48h,72h,使用倒置显微镜观察细胞形态变化并拍照片。
    结果:胃癌细胞株阴性对照组细胞生长状况良好,在镜下观察可见,透明度大、折光性强、细胞轮廓不清、形态较规则、贴壁性好。相反,给药组胃癌细胞生长状态不良,细胞折光性变弱、轮廓增强、胞质中常出现空泡、脂质和颗粒样物、细胞之间空隙加大、细胞变得不规则、贴壁性不好,部分细胞成凋亡状态,细胞变圆,细胞贴壁性变差,细胞膜发生皱缩、凹陷,并可见细胞凋亡小体。
    实施例4 流式细胞仪(FCM)分析癌细胞周期和凋亡
    分别接种胃癌细胞于6孔板和给药于6孔板,收集上述处理后的包括贴壁和悬浮的细胞,用4℃预冷PBS洗涤细胞一次,用低温离心机于4℃以转速1000rPm离心10min,缓慢加入lml?20℃预冷70%乙醇于4℃固定过夜,再用4℃预冷的PBS漂洗细胞两次,用上述离心条件离心,加100μg/ml的PI染色剂150μl和0.4%triton150μl,4℃避光染色30min,于30min内用FCM进行细胞周期DNA含量分析,确定细胞周期分布。
    细胞周期和凋亡采用CellQuest及Motifit分析软件分析。
    结果:多伞阿魏挥发油样品可显著使胃癌细胞SGC?7901凋亡。
    流式细胞仪分析可知,多伞阿魏挥发油作用后,G0/G1细胞数增加,S和G2/M期细胞数减少,细胞增殖指数降低,显示多伞阿魏挥发油作用后细胞分裂增殖被抑制在G0/G1—S期。通过流式细胞仪(FCM)分析胃癌细胞周期和凋亡,初步探索了此类化合物抑制胃肿瘤细胞增殖的初步机制。
    最后应说明的是:显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的?;し段е?。

    关于本文
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