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    重庆时时彩官网cqssckjhmzstt: 基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201310211087.2

    申请日:

    2013.05.30

    公开号:

    CN103308696A

    公开日:

    2013.09.18

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20130530|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
    发明人: 肖迪; 张建中; 姜海; 崔步云; 张慧芳
    地址: 102206 北京市昌平区昌百路155号
    优先权:
    专利代理机构: 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 代理人: 王朋飞
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310211087.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.06.24|||2013.10.23|||2013.09.18

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种快速检测血液样本中布鲁氏菌的试剂盒,涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明基于质谱技术,构建了针对血液中布鲁氏菌检测的特异性多肽质谱模型,以及使用质谱技术进行布鲁氏菌检测的试剂盒。本发明试剂盒能够通过特异性指纹图谱鉴定血液样本中的布鲁氏菌,准确度高、重复性好,2小时内可完成96个样本的检测,比传统检测方法至少提前5天完成检测,且检测成本低廉,结果可靠,具有良好的应用前景。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种检测布鲁氏菌(Brucella)特征蛋白的质谱模型,其特征在于,含有以下特征蛋白,其质荷比m/z分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9。

    2.   一种检测布鲁氏菌特征蛋白质谱模型的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
    1)将在培养基上培养至对数生长期的布鲁氏菌标准菌株接种于培养瓶中,使菌浓度达到1010CFU/ml,依次稀释7个数量级至103CFU/ml,37℃培养,0天、2天、4天、10天、15天;同时设阴性对照;
    2)每一取样时段,取上述8个数量级的菌液样本,采用乙醇/甲酸法进行质谱前预处理,制备蛋白样品;
    3)将上述8个数量级的菌液、在5个时间段的40个蛋白样品以及阴性对照血液样品处理得到的蛋白分别上质谱仪样品靶,设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理;采集2000?20000Da范围内的肽图谱;对所得数据进行统计学处理,得到具有统计学意义的布鲁氏菌8个特征蛋白,其质荷比分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9,将上述8个特征蛋白作为检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型。

    3.   如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤3)将蛋白样品上质谱仪样品靶,样品干燥后,覆盖基质,所述基质为α?氢基?4?羟基肉桂酸在50%乙腈、2.5%三氟乙酸中的饱和液。

    4.   如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中质谱仪为MALDI?TOF质谱仪,氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da,源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率20Hz,调整总采集频次使谱图总强度大于10000;每次数据采集前,采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器,使分子量误差<0.02%。

    5.   如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤3)所述的标准化处理包括归一化、基线修正、平滑、去噪;通过设定MSP参数,质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%,最多峰数目70,每个浓度的标准由20张谱图构建标准参考谱。

    6.   用于布鲁氏菌检测的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述质谱模型的图谱。

    7.   如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还含有100%色谱级乙醇;70%色谱级甲酸;色谱级乙腈;基质:α?氰基?4羟基肉桂酸,基质溶解液:50%18.2兆欧超纯水,50%乙腈,2.5%三氟乙酸;布鲁氏菌标准菌株蛋白样品为阳性对照。

    8.   如权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于,其工作步骤为:
    1)取待测体液样品,离心,弃上清,加入纯水;再按体积比1:3加入100%色谱级乙醇,充分混合,再次离心,弃上清,不残留液体;
    2)加入70%色谱级甲酸,混匀,再加入同体积的色谱级乙腈,混匀后离心,取上清液;
    3)将步骤2)得到的上清液上质谱仪样品靶,设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理;采集2000?20000Da范围内的肽图谱;肽图谱结果与权利要求1所述质谱模型的图谱进行比对,若得到的蛋白质谱图中含有以下8个特征蛋白的质荷比m/z分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9中的至少5个,则待测体液样品中存在布鲁氏菌。

    9.   如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述体液为血液、尿液、肺泡灌洗液或滑膜腔液。

    关 键 词:
    基于 技术 布鲁氏菌 快速 检测 试剂盒
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