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    重庆时时彩30日: 包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌或肺炎的组合物及其应用.pdf

    关 键 词:
    包含 硫氧还蛋白 作为 活性 成分 用于 诊断 卵巢癌 肺炎 组合 及其 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201180036083.4

    申请日:

    2011.12.21

    公开号:

    CN103314299A

    公开日:

    2013.09.18

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20111221|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; G01N33/53; G01N33/574 主分类号: G01N33/68
    申请人: 培材大学校产学协力团
    发明人: 金一韩
    地址: 韩国大田广域市
    优先权: 2011.12.14 KR 10-2011-0134723
    专利代理机构: 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 代理人: 楼高潮
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201180036083.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.06.10|||2013.10.23|||2013.09.18

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌和/或肺炎的组合物以及其应用。此外,还公开了一种用于卵巢癌和/或肺炎的诊断试剂盒和一种诊断方法。因为将较容易取样的血液用作样品,该诊断方法非常简单且与涉及活检的常规方法相比不会施加负荷给病人。此外,该方法因其高的诊断敏感性和选择性而可用于卵巢癌的早期诊断。硫氧还蛋白1可用作肺炎的诊断标记物,其特征在于降低的血清水平,具有高的肺炎选择性,从而容易区别肺炎与癌症以及除了癌症外的疾病。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种用于诊断卵巢癌和肺炎两者或其一的组合物,其包含作为活性成分的硫氧还蛋白1。

    2.   一种用于诊断卵巢癌和肺炎两者或其一的试剂盒,其包含权利要求1所述的组合物。

    3.   一种用于诊断卵巢癌和肺炎两者或其一的试剂盒,其包含作为活性成分的与硫氧还蛋白1特异性结合的抗体。

    4.   一种通过抗原?抗体反应测量样品中硫氧还蛋白1水平的方法,从而提供用于诊断卵巢癌和肺炎两者或其一的信息。

    5.   根据权利要求4所述的方法,其中,所述样品选自由组织、提取物、细胞溶解产物、全血、血浆、血清、眼内液、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑液和腹膜液构成的组。

    说明书

    说明书包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌或肺炎的组合物及其应用
    技术领域
    本发明涉及一种包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌或肺炎的组合物及其应用。
    背景技术
    据发现硫氧还蛋白(Trx)是一种捐献氢离子给核糖核苷酸还原酶的辅酶,一种对于大肠杆菌中DNA合成必不可少的酶。Trx用作细胞内氧化还原作用控制剂,其特征在于具有?Cys?Gly?Pro?Cys?活性部位,其中两个邻近的半胱氨酸残基可交换地存在于二硫键(S?S)的氧化形式与二硫醇(?SH?SH)的还原形式之间。Trx是一种12kDa的蛋白质并包含有硫氧还蛋白1(Trx1)和硫氧还蛋白2(Trx2)。Trx具有多种生物学活性。例如,Trx用作生长因子并清除对细胞有毒的过氧化氢。此外,Trx对真核细胞中广泛使用的转录因子NF?kB(核转录因子kB)的活性具有影响。在这方面,Trx通过裂解氧化蛋白质的二硫键将它们转变成其还原状态来参与细胞凋亡和肿瘤发生的调节。由于这些生物学活性,Trx作为用于预防细胞损伤的抗氧化治疗剂以及抗癌剂吸引了广泛的关注。
    卵巢癌是一种出现在卵巢中的恶性肿瘤,五十岁到七十岁的妇女中发病率最高。根据韩国2002年的统计,每年有大约1000?1200名的妇女诊断出罹患卵巢癌,是在韩国妇科癌症发生中排在子宫颈癌后的第二位。
    上皮性卵巢癌,占卵巢癌的90%以上,对于大多数患者来说,是在第三阶段或者更晚期的阶段才诊断出来的,因此患者的五年存活率小于40%。在大多数情况下与其它癌症一样,卵巢癌的真正起因仍然是未知的。罹患卵巢癌的风险似乎受到多种因素的影响。具有卵巢癌家族史的妇女可能具有较高的风险,这表明卵巢癌的遗传特性。BRCA分析诊断为阳性的人要比BRCA诊断为阴性的人受到卵巢癌攻击的可能性高10倍。而这,也就是为什么需要提前并周期性地进行体检的原因。然而,大部分卵巢癌的(超过95%)病例是在没有家族史的人中诊断到的。其次,罹患乳腺癌、子宫内膜癌和/或直肠癌病史或家族史的病人可能具有较高的卵巢癌风险。特别地,因为在乳腺癌和卵巢癌之间有紧密的关联,所以据信具有乳腺癌病史的人感染卵巢癌的风险比没有该病史的人高两倍,而具有卵巢癌病史的人比没有这种病史的那些人有3?4倍患乳腺癌的风险。另一个因素与排卵有关。排卵越少,卵巢癌的风险越低?;吃惺歉龅湫偷睦?。与那些从未生育孩子的妇女相比,生育过1个孩子的妇女罹患卵巢癌的风险降低了10%,而在经历过三次分娩的妇女中,罹患卵巢癌的风险降低了高达50%。产后,母乳喂养也能降低某种卵巢癌的风险,因为它能抑制排卵,延迟月经。同样地,口服避孕药的使用也是?;ひ蛩?,因为它们抑制排卵。摄取高脂肪和高蛋白食物的饮食习惯以及包括石棉和滑石的环境因素也能增加卵巢癌风险。
    由于其几乎没有明显症状,大约60%的卵巢癌病例最初在显著发展的阶段诊断出来。因此,推荐妇女在一年的定期时间进行妇科癌症的体检。通常,卵巢癌的诊断由妇科医生对卵巢进行是否已增大的体检开始。必要时,可用妇科超声显像检查卵巢肿块。此外,对于CA125肿瘤标记物可进行验血以确定卵巢肿块是简单的囊肿还是恶性肿瘤。
    由于超声波扫描术或验血都不是完美的,这两种检查的组合是迄今为止发现卵巢癌的最有前途的方法。医生在完全考虑了所有的数据,包括患者年龄、现在和过去的个人和家族病史、超声显像和验血结果以及必要时观测预定一段时间后作出决定。当怀疑肿块为癌症时,可在执行计算机辅助断层成像(CT)或核磁共振成像(MRI)后进行外科手术。在活组织检查后证实癌症。
    结合珠蛋白(HP)是一种血液中过多存在的蛋白质,像白蛋白一样。血清蛋白主要在肝细胞、真皮细胞、肺细胞和肾脏细胞中合成且释放到血液中。结合珠蛋白以四聚体蛋白存在,包含通过二硫键连接的两个α链和两个β链。在血浆中,结合珠蛋白结合从红细胞中释放的游离血红蛋白,因而抑制了血红蛋白的氧化性活性(Wassell J.(2002)Haptoglobin:function and polymorphism.Clin Lab.46,547?552/Langlois M.R.&Delanghe J.R.(1996)Biological and clinical significance of haptoglobin polymorphism in humans.Clinical Chemistry42,1589?1600)。最近关于蛋白质组学的研究报告表明,结合珠蛋白可由皮下和腹部脂肪细胞中释放,尽管量非常少。蛋白质在成人肝脏中合成,但在胎儿肝脏中不合成。结合珠蛋白是急性期蛋白(APP),其血浆水平响应于任何感染或炎性过程快速升高。
    结合珠蛋白在人类中以两种等位基因形式存在,即所谓的Hp1和Hp2,后者由于Hp1基因的部分重复而出现。因此,已经在人体中发现Hp的三种基因型:Hp1?1、Hp2?1和Hp2?2(Maeda N,McEvoy SM,Harris HF,Huisman TH,Smithies O.(1986)Polymorphisms in the human haptoglobin gene cluster:chromosomes with multiple haptoglobin?related(Hpr)genes,Proc Natl Acad Sci U S A.83,73957399/Patzelt D,GeserickG,Schroder H.(1988)The genetic haptoglobin polymorphism:relevance of paternity assessment,Electrophoresis9,393397)。存在两种Hpα链(Hpα)亚型:α1和α2。这些α蛋白质以各种种类的位置变体而存在(Sadrzadeh SM,Bozorgmehr J.(2004)Haptoglobin phenotypes in health and disorders.Am J Clin Pathol.121Suppl:S97?104)。
    涉及蛋白质基因的疾病有糖尿病肾病和克罗恩氏病。因为结合珠蛋白的确是一种急性期蛋白,任何炎症过程如感染、极度紧张、烧伤、严重挤压伤、过敏症等,都可使血浆中的结合珠蛋白的水平升高。最近的报告表明,罹患包括卵巢癌的癌症的病人具有较高的血浆结合珠蛋白的水平。
    考虑到这些报道,结合珠蛋白因缺乏特异性而不适用于用作肺炎的诊断标记物。Hp可用作癌症标记物,因为它的血浆水平在包括卵巢癌的各种癌症中升高,但它不能用于辨别癌症和肺炎。因此,对于标记物存在这样一种需求,即,通过该标记物能够在已经与癌症区别后,对肺炎进行明确地诊断和预测。同样地,因为大部分癌症标记物的表达水平响应于炎症而增加,因此对于癌症标记物存在迫切需求,该标记物的质粒水平响应于癌症而增加,但并不响应于炎症而增加。
    发明内容
    技术问题
    旨在克服现有技术中存在的问题,使用较容易获得的血液作为样品,详细并深入研究了简单又选择性诊断卵巢癌和肺炎的方法而完成了本发明,结果发现,健康人与患有疾病的病人的硫氧还蛋白1的血浆水平不同。
    技术方案
    本发明的一个目的在于提供一种包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌和/或肺炎的组合物。
    本发明的另一目的在于提供一种包含组合物的用于诊断卵巢癌和/或肺炎的试剂盒。
    本发明的再一目的在于提供一种用于诊断卵巢癌和/或肺炎的试剂盒,其包含与硫氧还蛋白1特异性结合的抗体。
    本发明的又一目的在于提供一种通过抗原?抗体反应测量样品中硫氧还蛋白1浓度的方法,从而提供用于诊断卵巢癌和/或肺炎所需要的信息。
    在一个实施方式中,样品选自由组织、提取液、细胞裂解物、全血、血浆、血清、眼内液、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑液和腹膜液构成的组。
    技术效果
    因为采用血液作为样品,且它是较容易取样的,因此,根据本发明的诊断卵巢癌和/或肺炎的方法非常简单,并且与涉及活检的常规方法相比不会给病人带来负担。此外,本发明的方法由于其高的诊断敏感性和选择性可用于卵巢癌的早期诊断。同时,硫氧还蛋白1可用作肺炎的诊断标记物,其特征在于对于肺炎具有高选择性的低血清水平,因此容易与癌症和非癌症疾病区别肺炎。
    附图说明
    图1为由酶联免疫吸附试验测定的显示正常男性和女性对照的血清Trx1水平与年龄的相关性的图示。
    图2为由酶联免疫吸附试验测定的显示卵巢癌患者的血清Trx1水平与年龄的相关性的图示。
    图3显示了血清Trx1水平随卵巢癌发展而绘制的图。
    图4是显示患有卵巢癌和炎性疾病的病人中通过酶联免疫吸附试验测定的血清Trx1水平的图示,该炎性疾病包括社区获得性肺炎(CAP)、关节炎、类风湿性关节炎、特应性皮炎和心血管疾病。
    图5是示出了比较肺炎病人的血清Trx1与结合珠蛋白(Hp)水平的图表。
    图6示出了在正常男性和女性对照以及肺炎病人中检测肺炎发病情况时,Trx1与肺炎标记物Hp的血清水平的相关性。
    具体实施方式
    本发明人对简单化和选择性的诊断卵巢癌或肺炎进行了研究并发现患有该疾病的病人和健康人之间硫氧还蛋白的血浆水平存在差异,由此完成了本发明。
    下面将详细说明本发明。
    本发明涉及一种包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌或肺炎的组合物及其应用。
    此外,本发明涉及一种包含硫氧还蛋白1作为活性成分的用于诊断卵巢癌和/或肺炎的组合物和试剂盒,以及一种包含硫氧还蛋白特异性抗体的用于诊断卵巢癌和/或肺炎的试剂盒。
    此外,本发明涉及使用抗原?抗体反应测定样品中硫氧还蛋白1的浓度的方法,从而提供用于诊断卵巢癌和/或肺炎所需的信息。对样品也不给予任何限制。所述样品选自由组织、提取物、细胞溶解产物、全血、血浆、血清、眼内液、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑液和腹膜液构成的组。
    在本发明中,经发现,通过酶联免疫吸附试验所测量的硫氧还蛋白1在卵巢癌患者血液中存在的浓度显著高于正常人血液中的浓度。此外,卵巢癌患者中硫氧还蛋白1的血浆水平经测量显著低于非癌症的炎性疾病和心血管疾病病人中的血浆水平。此外,经观察,硫氧还蛋白的血浆水平随着癌症的发展升高。即使在早期卵巢癌病人中也能检测出比正常人显著高的硫氧还蛋白1的血浆水平。经观察,确定对常规的卵巢癌标记物CA125呈阴性的卵巢癌患者具有与CA125?阳性的患者一样高的血浆硫氧还蛋白1的水平。因此,根据本发明,硫氧还蛋白1可用作本发明的卵巢癌的诊断标记物。
    此外,患有非癌症的炎性疾病的患者具有比正常人低的血浆硫氧还蛋白1水平。特别地,经发现,肺炎患者具有比正常人显著低的硫氧还蛋白1浓度,这表明硫氧还蛋白1能够使非癌症的炎性疾病以优良的方式与其它疾病相区别。
    如上所述,由于使用较容易取样的血液作为样本,与涉及活检的常规方法相比,本发明的卵巢癌的诊断方法非常简单,不会给患者带来负担。此外,本发明的方法由于其高的诊断敏感性和选择性可用于卵巢癌的早期诊断。同时,硫氧还蛋白1可用作肺炎的诊断标记物。
    通过以下的实施例可对本发明有更好的理解,以下实施例的提出是示例性的,但并不能解释为对本发明的限制。
    实施例
    受试者
    所有正常人(对照)和患者的血清都获得自白种高加索人,其血清和临床信息由Asterand(美国)和Bioserve(美国)提供,总结在下面的表1和表2中。
    表1

    癌症阶段


    CAl25测试



    对血浆蛋白质水平进行酶联免疫吸附试验
    进行ELISA(酶联免疫吸附试验)以定量分析血液蛋白质。
    使用ELISA试剂盒利用目的抗体确定蛋白质的血清水平(快速ELISA试剂盒(兔),GenScript)。关于此,通过向兔体内注射纯化的蛋白质形成抗血清并在蛋白质A柱中纯化抗血清而获得硫氧还蛋白1(Trx1)和结合珠蛋白(Hp)的抗体。
    通过在450nm处测量三次吸光率以测定蛋白质水平,并给出三次测量值的平均值。为了统计分析,使用了软件Graphpad prisn(5.04版本)(Graphpad软件)。
    实施例1:卵巢癌患者中的Trx1水平
    测定了正常对照和卵巢癌患者之间的血液Trx1水平差异。
    详细地,在分布于很宽年龄范围内(年龄分布:41?85的年龄)的49名正常女性和112名卵巢癌症患者中测量血清Trx1水平,并进行ROC(受试者工作特征)曲线绘制。
    在图1示出了浓度测量值图示中并统计总结于表3中。通过ROC曲线的偏积分计算得到的AUC(ROC曲线下的面积)值以及敏感性值和特异性值总结在下面的表4中。
    表3


    表4

    如图1和表3中所示,在女性正常对照(NF)和卵巢癌组(OC)中TrX1的平均浓度值分别为0.459和0.677,表明在卵巢癌患者中Trx1的血清水平增加了约48%。同时,硫氧还蛋白1在对传统卵巢癌标记物CA125呈阴性(0.705)和阳性(0.711)的组中测量的浓度基本上相同。
    该实验数据中,其中在CA125阴性和阳性的卵巢癌患者中,Trx1的血清水平要比正常对照中的水平高很多,这表明Trx1作为卵巢癌的诊断标记物要比传统标记物CA125更加有效。
    此外,对应于表1中阶段I和等级1的早期卵巢癌患者,经发现具有0.630和0.684的浓度,它们分别比正常浓度0.459高37%和49%(表4)。
    如表4中所示,阶段I和等级1的患者组中的AUC值分别为0.904和0.964,它们与针对所有卵巢癌患者测量的AUC值0.93相似。此外,图2示出了随着癌症的进展血清Trx1水平升高。在所有的情况下,作为发现癌症可能性指标的AUC值为0.9或更高,作为与正常组区别指标的特异性大约为80%,且作为检测癌症病人指标的敏感性在81%以上。
    实施例2:在卵巢癌患者和非癌症疾病患者中的Trx1血清水平
    在卵巢癌和非癌症患者之间进行了血清Trx1水平的检查。
    使用ELISA测量了罹患卵巢癌(OC)、肺炎(CAP)、关节炎、心血管疾病、类风湿性关节炎和特应性皮炎的患者以及正常男性和女性对照中的血清Trx1水平。结果在图4中示出,测量值的统计总结在表5中。通过测量值的ROC曲线分析获得的AUC、敏感性、特异性和截止值在下面的表6中给出。
    表5

    表6


    如表5中所示,正常男性和女性对照以及非癌症患者组的血清Trx1水平分布在0.4?0.5的范围内,这显著低于卵巢癌组的测量值0.667(表3)。如图4中所示,几乎所有的非癌症组的测量值都低于区别正常对照与卵巢癌组的截止值0.5527。为了证实这一结果,对卵巢癌组的测量值进行ROC曲线分析,并将正常男性和女性对照组以及非癌症组的Trx1测量值用作参照。如从表6的结果中所收集到的,ROC分析结果通常在对照组和非癌症组之间是相似的,表明Trx1可用作能够清楚识别卵巢癌患者是否它们已经感染非癌症疾病的理想的卵巢癌标记物。关于截止值,它们全部都落在0.54?0.57的范围内,这表明了用作卵巢癌标记物的Trx1的优越性。
    结合起来考虑,上面获得的数据表明Trx1能够以大约高达93%的可能性区别卵巢癌组与正常女性对照组,并且不论病人是否罹患非癌症疾病,Trx1都能用作对于卵巢癌具有优良敏感性和选择性的卵巢癌标记物。
    实施例3:肺炎患者的血清Trx1水平
    为了证明Trx1作为卵巢癌标记物的实用性,分析了肺炎患者血清的Trx1水平,肺炎是相对较大的肺部器官的炎性疾病。原因在于,因为响应于氧化应激,Trx1的细胞内合成增加,血清Trx1水平也可响应于炎性疾病如肺炎而升高。如果这样的话,作为卵巢癌标记物的Trx1的使用将会受限制。
    如图4中所示,肺炎患者中的血清Trx1水平处于显著低于其它非癌症疾病患者中的下限值。这样,检查了作为诊断标记物的Trx1相对目前用作标记物的结合珠蛋白(Hp)的有效性。在这点上,测量了正常男性(n=50)和女性(n=49)以及男性(n=40)和女性(n=40)肺炎患者(CAP_M,CAP_F,CAP_MF)的正常对照中两种蛋白质(Trx1和Hp)的血清水平。结果在图5中显示。为了分析两种蛋白质(Trx1和Hp)作为肺癌标记物的使用,对测量值进行ROC曲线绘制并将结果概括在下面的表7中。
    表7

    对于相对正常男性和女性对照的男性和女性肺炎组,如表7中能看到的,Trx1和Hp的AUC值测量为0.756和0.882,敏感性分别为52.2%和81.2%,特异性为92.9%和83.8%。该数据显示,Trx1和Hp分别在特异性和选择性方面是优良的。
    根据数据能理解的是,Hp对于罹患肺炎的男性和女性患者来说是良好的标记物,而Trx1在女性患者中具有与Hp相似的功能。Hp和Trx1之间的特性区别在于肺炎组比正常对照具有较高的血清Hp水平但较低的血清Trx1水平。为了证实这些相反的结果,分析了肺炎组的Trx1测量值和Hp测量值之间的相关性,结果在图6中示出。
    经发现,Trx1测量值与Hp测量值成反比,如图6中所示。此外,该关系更确定地建立在女性肺炎组中(图5和表7)。
    根据上述获得的结果,Trx1可用作肺炎的诊断标记物,其特征在于与对照组相比,具有较低的血清水平。由于该特性,Trx1在选择肺炎患者方面比Hp占优势。这是因为在患有包括卵巢癌的各种癌症和非癌症疾病以及肺炎的患者中血清Hp水平升高,而没有特异性。
    因此,由于它能够以大约93%的可能性将卵巢癌患者与正常女性相区别,Trx1不仅可用作卵巢癌标记物,而且也能用作肺炎的诊断标记物。与Hp不同,和对照组相比,卵巢癌患者中Trx1的血清水平显著升高,不论病人是否罹患非癌症疾病,对卵巢癌具有优良的敏感性和选择性。
    尽管出于示例性目的已经公开了本发明的优选实施方案,本领域的技术人员将会明白,在不脱离附加权利要求中公开的本发明的范围和实质下,能够进行各种修改、增加和替换。
    工业实用性
    正如到此所描述的,本发明提供了一种通过测量血清Trx1水平用于诊断卵巢癌和/或肺炎的方法。此外,提供了一种包含Trx1作为活性成分的用于诊断卵巢癌和/或肺炎的组合物和包含该组合物的诊断试剂盒?!  ∧谌堇醋宰ɡ鴚ww.www.4mum.com.cn转载请标明出处

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